重组蛋白用宿主细胞蛋白（HCP）残留检测抗体制备

由于 HCPs 属于复杂的多分析物，为制备覆盖率尽可能高的抗体（以覆盖工艺特有的高风险 HCPs），需采用可靠的免疫策略。获得符合性能要求的抗体后，需借助经过验证的 2D 或 LC-MS 方法对抗体覆盖率进行表征，确保抗体可充分覆盖各实际工艺下产生的 HCPs。在拥有代表性抗原与优良性能抗体的基础上，开展 ELISA 检测体系开发，涵盖原辅料筛选与制备研究、各组分工艺及反应体系研究、稳定性研究等重要内容。检测体系开发完成后，需依据 ICH 及药典要求开展分析方法验证评估，确保体系的线性、范围、检测限、定量限、准确度、精密度、专属性及耐用性均满足法规要求。

宿主细胞蛋白（HCPs）是生物制品生产过程中产生的重要工艺相关杂质，不仅可能引发患者不良免疫反应、超敏反应，还可能造成产品蛋白降解等问题，进而影响生物制品的安全性与有效性，因此成为生物制品质量控制中的关键指标。目前 HCPs 残留检测的常用方法为 ELISA 法，该方法操作简便、灵敏度高且检测通量较高，是 HCPs 残留的日常放行检测方法，各国药典均对采用酶联免疫法开展 HCPs 残留检测作出规定。不过，采用 ELISA 法检测 HCPs 残留仍存在不少挑战：在实际生产工艺中，宿主细胞来源、生产工艺路线、纯化技术、生产规模等因素，均可能改变 HCPs 的种类与复杂程度，给检测带来不确定性。

大肠埃希氏菌（Escherichiacoli，简称E.coli，又称大肠杆菌）作为模式微生物，在生命科学研究领域应用较多。伴随基因治疗产业的快速发展，它还成为质粒DNA（pDNA）生产的主要宿主菌。质粒样品常规提取工艺中，常使用强碱性溶液进行细胞裂解与蛋白质变性，这种处理使其中的宿主细胞蛋白（HCPs）与传统物理破碎法得到的HCPs差异明显，进而导致采用免疫学原理的检测方法时，残留检测结果偏差较大。湖州申科生物的E.coli克隆菌碱裂HCP残留检测试剂盒，适用于大肠埃希氏菌（即大肠杆菌）克隆菌株的HCPs检测，涵盖DH5α、Top10、JM109等常见菌株。该试剂盒的抗体制备过程中，采用碱裂工艺制备的HCPs免疫动物，得到专属抗体，可用于经碱液裂解工艺处理后的宿主细胞蛋白（HCPs）定量检测。

LC-MS/MS 作为成熟稳定的蛋白质组学分析技术，依托超高分辨率与准确度，在生物分析领域中占据关键地位。该技术不仅可对低含量宿主细胞残留蛋白（HCP）开展定性检测，还能通过构建专属蛋白质谱库准确鉴定 HCP 的具体种类，为深度解析残留蛋白组成提供重要支撑。不过该技术应用中面临的主要挑战，是如何优化 LC-MS 方法以契合 GMP 规范对产品放行检测的严苛要求。在质谱检测环节，引入表征明确的内标与外标蛋白，可准确分析 HCPs 的整体组成，并有效识别其中具有潜在风险的高风险蛋白。这一技术手段不仅为开发产品专属 HCP ELISA 检测方法提供有力数据支撑，还可助力工艺优化升级，加快推进生物制品从研发到获批上市的全流程进度。

美国药典 <1132> 与欧洲药典 < 2.6.34 > 建议，对即将进入商业化生产（临床 III 期及后续阶段）或生产工艺已稳定的生物制品，采用定制化 ELISA 试剂盒开展宿主细胞蛋白（HCP）残留检测，背后原因主要包括四点：①确保检测方法能充分覆盖实际工艺产生的 HCPs，防止漏检关键杂质；②为更准确的免疫原性与安全性评估提供支持；③提供真实的工艺表征数据，而非推测性数据；④满足商业化生产质量控制对方法一致性的要求。此外，研究人员对当前市场常见的 HCP ELISA 商业化试剂盒进行测试，并将其与 HCP ELISA 定制化试剂盒对比。实验结果显示，不同商业化试剂盒检测同一样品的数值差异明显，且准确性均低于定制化试剂盒 —— 这一结果表明，定制化试剂盒更能满足产品质量控制的实际需求。

宿主细胞蛋白（HCP）多与细胞关键功能相关，像细胞增殖、基因转录、蛋白合成修饰、细胞存活及凋亡等，工艺过程中会通过细胞分泌，或因细胞死亡、裂解而释放。生产环节中，主要有三方面因素影响HCP的组成与丰度：①宿主细胞基因组调控及培养工艺：特定工艺下潜在HCP数量可能极多，且并非所有基因都会表达，部分基因的表达存在时间与条件差异；例如大肠杆菌约含4300个基因，不同工艺产物会经历独特的翻译后修饰，增加HCP的总数与生化复杂性。研究表明，大肠杆菌表达的蛋白存在数量差异，这可能是对环境条件的适应性反应，但85-90%有潜在免疫原性的HCP在不同发酵过程中均会出现。②产物表达方式：宿主细胞与外源基因、载体及辅助成分构成的体系，可实现稳定、瞬时及诱导表达；以大肠杆菌为例，常见的表达形式包括胞内表达、分泌表达、可溶性表达、不溶性包涵体形式，以及融合与非融合表达。③纯化步骤及产品自身特性：纯化过程中能去除99%以上的HCP，但仍有残留HCP保留在产品中，这些残留HCP可能与产品结合，随产品一同完成纯化。