热原是指微量即可引发恒温动物体温异常升高的物质，分为内源性（如细胞因子）与外源性两类，外源性热原又涵盖微生物来源（革兰氏阴性菌脂多糖 LPS、革兰氏阳性菌脂磷壁酸 LTA、病毒、真菌等）与非微生物来源（灰尘、橡胶降解产物等）。传统细菌内毒素检查法（BET）只能检测革兰氏阴性菌的 LPS，无法覆盖非内毒素热原，而单核细胞活化试验（MAT）可弥补这一缺陷。其原理是：热原通过活化单核细胞表面的 Toll 样受体（TLR，如 TLR4 识别 LPS、TLR2/TLR6 识别 LTA），启动先天免疫反应，促使细胞释放 IL-6、TNF-α 等促炎细胞因子；随后采用 ELISA 法检测 IL-6 浓度，结合 LPS 标准曲线推算样品中总热原含量，实现对内毒素与非内毒素热原的同步检测，契合《中国药典》9301 指导原则中 全场景防控热原风险”的要求。
与传统方法相比，MAT 法能更覆盖各类热原，保障产品安全性。湖北热原检测单核细胞活化反应测定法
中国药典对 MAT 法热原检测要求 4 复孔，未明确 CV 限值，需结合细胞实验特性合理解读与操作。药典不设 CV 限值的主要原因是：MAT 法基于细胞反应，细胞活性易受环境微小变化（如温度、pH）影响，存在天然不稳定性，过严的 CV 要求可能脱离实际；但实验室可通过积累多批次数据，制定内部 CV 控制范围（如定量上下限 CV≤30%、25%），确保检测重复性。关于 3 复孔的适用性：若长期数据显示 CV 控制良好（如连续 10 批次 CV<20%），且样品为中间过程检测（非 QC 放行），可尝试 3 复孔，但需同步设置加标对照，验证结果可靠性；若为 QC 放行检测，仍建议按 4 复孔操作，符合药典下限要求。对于异常点处理，可采用狄克逊准则（Q 检验）等统计学方法 —— 如某复孔 IL-6 检测值偏离平均值 30% 以上，且无明显操作误差（如加样错误），可判定为异常点并剔除，但需在原始记录中详细说明原因，确保数据可追溯，避免随意剔除导致结果失真。
江苏合规性热原检测规范PBMC（外周血单个核细胞）用于 MAT 检测时供体差异大，IL-6 释放波动明显，标准化难度高于单核细胞系。
中国药典与欧洲药典对 MAT 热原检测的细胞类型及复孔数有明确要求，且存在细节差异。细胞类型上，两者均认可人全血、PBMC（外周血单个核细胞，至少 4 个供体，欧洲药典建议 8 个供体），中国药典明确将单核细胞系纳入，欧洲药典则要求单核细胞系需做支原体污染检测、细胞鉴别等；检测方法均为 “热原刺激细胞 + ELISA 检测 IL-6/IL-1β/TNF-α”。复孔数方面，两者均规定平行孔≥4、浓度点≥4，中国药典额外要求标曲 r≥0.90，主要目的是通过多重复孔抵消 PBMC 的不稳定性，确保热原检测结果准确可靠。
MAT法热原检测中，ELISA 加终止液后的读数时间需严格控制，以保障 IL-6 检测信号稳定。湖州申科生物MAT试剂盒说明书明确要求，终止液添加后需在 10 分钟内完成读数，且需避光操作 —— 原因在于，终止液（如硫酸）会终止 TMB 显色反应，但生成的黄色产物在光照下易降解，超过 10 分钟后 OD 值会下降，导致 IL-6 检测值偏低。读数前需进行 30 秒震荡混匀，确保孔内液体浓度均匀，避免因局部浓度差异导致复孔 OD 值波动。酶标仪波长需设置为 450nm，若仪器含 600nm 参考波长，可同时检测 600nm 波长以扣除背景干扰（如细胞碎片导致的光散射），提升检测准确性。需注意的是，读数时不可覆盖封板膜或盖子，避免膜上凝结的水蒸气滴入孔中，导致 OD 值异常升高。若因仪器故障无法及时读数，需将微孔板密封后置于 4℃避光保存，并在 30 分钟内完成读数，同时在记录中注明延迟原因，评估延迟对结果的影响（如延迟 20 分钟，OD 值可能下降 15%，需校正后使用）。
热原有广谱来源特征，革兰阴性菌（内毒素/LPS）致热能力强，革兰阳性菌、真菌、病毒均可产生。
MAT 法热原检测的关键机制是 “热原活化单核细胞 TLR 受体，触发炎症因子分泌”，TLR 受体的全覆盖是保障检测无遗漏的关键。不同热原需活化不同 TLR 受体：最常见的内毒素（LPS）主要活化 TLR4，而革兰氏阳性菌的非内毒素热原（如脂磷壁酸）需活化 TLR2/6，真菌多糖活化 TLR2/4，病毒核酸活化 TLR3/7/8 等。因此，MAT 试剂盒配套细胞需具备全覆盖的 TLR 受体表达—湖州申科生物通过 Western blot 验证，其 HL-60 细胞系表达 TLR1-TLR9，可响应各类热原。为进一步验证覆盖能力，申科用不同非内毒素热原配体（如脂磷壁酸、酵母多糖）刺激细胞，结果显示所有配体均能诱导 IL-6 分泌，且呈良好量效关系，证明试剂盒可检出各类热原。若细胞 TLR 受体覆盖不全（如缺失 TLR2），则无法检测革兰氏阳性菌的非内毒素热原，导致漏检风险，因此 TLR 受体的全覆盖是 MAT 法热原检测的关键技术指标之一。
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PyroSHENTEK热原检测试剂盒采用“单核细胞+ELISA”标准化体系，检测结果稳定、重复性好，数据准确。湖北热原检测单核细胞活化反应测定法
革兰氏阳性菌注射剂产品只依赖内毒素检测存在安全风险，需结合热原检测特性制定防控方案。内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖成分，而革兰氏阳性菌可产生非内毒素热原（NEPs），如脂磷壁酸，这类物质同样能引发人体发热反应，若只检测内毒素，可能遗漏 NEPs 污染，导致临床用药风险。对此，风险评估需重点关注三点：一是建议开展家兔法与内毒素检测的一致性实验，对比两种方法的检测结果，排查是否存在内毒素未检出但家兔法阳性的情况；二是采用 MAT 法热原检测，其通过单核细胞活化机制，可同时识别内毒素与 NEPs，若 MAT 法检测阳性，需进一步追溯 NEPs 来源；三是若无法排除 NEPs 风险，必须按药典要求补充热原检测（如 MAT 法或家兔法），而非只依赖内毒素检测。尤其对于新药或工艺变更后的产品，需通过多方法验证，确保热原检测覆盖所有潜在致热物质，保障临床用药安全。
湖北热原检测单核细胞活化反应测定法
