传统细菌内毒素检查法（BET）只能检测革兰氏阴性菌的 LPS，无法识别革兰氏阳性菌 LTA、真菌酵母多糖、病毒鞭毛蛋白等非内毒素热原，存在漏检风险；同时，部分样品（如脂质体、表面活性剂制剂）会因内毒素吸附导致低内毒素回收（LER），BET法难以准确定量。MAT 法通过单核细胞表面的多种 TLR 受体（TLR1-TLR10），可识别不同类型热原：TLR4 识别 LPS、TLR2/TLR6 识别 LTA 与酵母多糖、TLR5 识别鞭毛蛋白、TLR3 识别病毒 dsRNA 等，实现 “全热原覆盖”。湖州申科生物热原检测试剂盒（MAT法）的验证数据显示，其对不同浓度非内毒素热原均有响应：如 0.1-100μg/mL 鞭毛蛋白可检测到 0.005-0.035EU/mL热原活性，0.1-10μg/mL LTA 对应 0.1-0.7EU/mL 热原活性，1-100μg/mL 雷西莫特（TLR7/8 配体）对应 0.5-3.0EU/mL 热原活性。此外，MAT法检测的是热原的生物活性（而非单纯 LPS 含量），可避免 LER 导致的假阴性，为CGT等高风险产品提供更有保障的热原检测方案。
MAT热原检测通过热原活化单核细胞释放促炎细胞因子，再经ELISA定量 IL-6判断供试品是否合格。北京抗体药物热原检测流程
热原是指微量即可引发恒温动物体温异常升高的物质，分为内源性（如细胞因子）与外源性两类，外源性热原又涵盖微生物来源（革兰氏阴性菌脂多糖 LPS、革兰氏阳性菌脂磷壁酸 LTA、病毒、真菌等）与非微生物来源（灰尘、橡胶降解产物等）。传统细菌内毒素检查法（BET）只能检测革兰氏阴性菌的 LPS，无法覆盖非内毒素热原，而单核细胞活化试验（MAT）可弥补这一缺陷。其原理是：热原通过活化单核细胞表面的 Toll 样受体（TLR，如 TLR4 识别 LPS、TLR2/TLR6 识别 LTA），启动先天免疫反应，促使细胞释放 IL-6、TNF-α 等促炎细胞因子；随后采用 ELISA 法检测 IL-6 浓度，结合 LPS 标准曲线推算样品中总热原含量，实现对内毒素与非内毒素热原的同步检测，契合《中国药典》9301 指导原则中 全场景防控热原风险”的要求。
湖北热原检测单核细胞活化反应测定法生物制品的高蛋白、螯合剂基质易对鲎试验产生抑制，rCR与MAT联合策略可消除干扰并控制热原。
含消除炎症成分的样品可能抑制 IL-6 产生，需通过科学评估排除干扰，确保 MAT 法热原检测结果准确。根据药典要求，若样品能抑制单核细胞促炎症因子释放，需通过以下步骤验证适用性：首先，选择样品 A、2A、4A 倍稀释（均不超过上限有效稀释倍数 MVD），避免高浓度消除炎症成分过度抑制；其次，进行供试品加标回收率实验，若回收率在 50%-200% 的合格范围，说明消除炎症成分未影响热原检测；再对比 “供试品配制的标曲” 与 “稀释液配制的标曲”，若两者 IL-6 检测值相差在 ±20% 以内，表明样品基质对检测无系统性干扰。例如，某消除炎症单抗样品经 2 倍稀释后，加标回收率达 120%，两种标曲 IL-6 值相差 15%，判定可适用 MAT 法。若出现回收率偏低（<50%），可尝试增加稀释倍数（如 8A 倍）或采用热灭活（若样品耐热）去除消除炎症活性；若仍无法排除干扰，需结合家兔法进行对比验证，避免因消除炎症成分导致假阴性。
MAT 法热原检测的稳定性需从细胞、试剂、操作、样品四维度严格把控。细胞层面，细胞活性与纯度直接决定热原响应能力，活性不足会减少炎症因子分泌，纯度低则引入杂细胞干扰；细胞批次间一致性也关键，TLR 受体表达、倍增时间差异会导致结果波动。试剂与耗材方面，标准品效价需溯源国际标准，避免降解影响标曲；试剂盒中细胞因子需质控，防止外源热原污染；培养液、缓冲液及无热原耗材（吸头、西林瓶）若热原控制不当，易引发假阳性。操作上，加样手法要统一（如 8 通道移液器液面一致），孵育需 37℃、5% CO₂稳定环境，试剂配制浓度准确，设备（酶标仪、洗板机）定期校准，操作偏差会直接导致异常。样品层面，自身干扰物质（消除炎症成分、高盐）、pH 偏离 6-8 或微生物污染，会抑制细胞活化或引入外源热原，需针对性预处理。
MAT 法通过热原活化单核细胞 TLR 受体，释放 IL-6 等细胞因子，ELISA 检测 IL-6 推算热原含量。
MAT法（单核细胞活化反应测定）热原检测基于人体免疫反应机制设计，原理是：内毒素（革兰氏阴性菌来源）与非内毒素热原（革兰氏阳性菌、霉菌、病毒等来源）进入人体后，会活化单核细胞或单核细胞系，使其释放 IL-6、IL-1、IL-1β、TNF-α 等促炎细胞因子。检测时将供试品与单核细胞 / 单核细胞系共孵育，再通过 ELISA 定量检测释放的 IL-6 含量，结合内毒素标准品绘制的标曲，即可判断供试品中热原含量是否符合规定，实现内毒素与非内毒素热原的全覆盖检测。
热原检测采用人外周血单核细胞（PBMC），优势是天然受体谱系完整，但供体差异导致变异系数（CV）高达25%。浙江非动物源热原检测
保持细胞活性稳定，是实现准确热原检测的基础条件。北京抗体药物热原检测流程
MAT 法热原检测的关键机制是 “热原活化单核细胞 TLR 受体，触发炎症因子分泌”，TLR 受体的全覆盖是保障检测无遗漏的关键。不同热原需活化不同 TLR 受体：最常见的内毒素（LPS）主要活化 TLR4，而革兰氏阳性菌的非内毒素热原（如脂磷壁酸）需活化 TLR2/6，真菌多糖活化 TLR2/4，病毒核酸活化 TLR3/7/8 等。因此，MAT 试剂盒配套细胞需具备全覆盖的 TLR 受体表达—湖州申科生物通过 Western blot 验证，其 HL-60 细胞系表达 TLR1-TLR9，可响应各类热原。为进一步验证覆盖能力，申科用不同非内毒素热原配体（如脂磷壁酸、酵母多糖）刺激细胞，结果显示所有配体均能诱导 IL-6 分泌，且呈良好量效关系，证明试剂盒可检出各类热原。若细胞 TLR 受体覆盖不全（如缺失 TLR2），则无法检测革兰氏阳性菌的非内毒素热原，导致漏检风险，因此 TLR 受体的全覆盖是 MAT 法热原检测的关键技术指标之一。
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