上海ELISA法宿主细胞蛋白（HCP）残留检测试剂盒开发要求

磷脂酶B样蛋白2（Phospholipase B-Like 2，PLBL2/PLBD2），因其强共纯化能力、强免疫原性和潜在的酶活性，被认为是CHO HCP的关键高风险因子之一。目前行业建议，需要开发特定的检测方法对这些已知蛋白或特定蛋白进行监控以更好地把控其潜在风险。SHENTEK^® CHO PLBL-2残留检测试剂盒（酶联免疫吸附法）是湖州申科生物自主研发的、具有完全自主知识产权的CHO PLBL-2蛋白通用检测试剂盒。本试剂盒适用于基于CHO表达系统的生物制品中CHO HCP高风险蛋白PLBL-2的定量检测。本试剂盒操作步骤少，快速，检测专一性强，性能稳定可靠。

大肠埃希氏菌(Escherichia coli，E. coli )又称大肠杆菌，其作为模式微生物被广泛应用于生命科学研究中。大肠杆菌是表达药用异源蛋白的常用微生物，在被批准的药用蛋白中，大约30%的产品以大肠杆菌作为表达宿主菌。与其他表达平台一样，尽管下游复杂的纯化步骤已经去除了大量的杂质，但终产品中仍会存在HCP残留风险，必须对其进行质量控制，使其符合放行标准。湖州申科生物E.coli表达菌HCP残留检测试剂盒用于大肠杆菌表达菌株BL21来源的宿主细胞蛋白定量检测，适用于重组蛋白类产品的工艺中间品和原液类样品，如白细胞介素（IL）、干扰素（rhIFN）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、肿瘤坏死因子（rhTNF）、促生长因子（EGF/FGF/PDGF）等。试剂盒检测步骤少，快速，专一性强，性能稳定可靠。

为什么定制化试剂盒是宿主细胞蛋白残留检测的优先选择？原因之一是来源特定工艺下抗原及校准品更具代表性。不同生物制品的上游生产工艺，包括培养基，培养条件，收获时机等差异，均会导致产生的HCPs的蛋白种类、丰度以及蛋白翻译修饰不同，因此进入到下游纯化工艺的HCP类型也随之发生变化，尤其是与药物主成分共纯化的HCPs会成为优势蛋白而存在于药物原液或制剂中。HCP定制化ELISA检测试剂盒通常选取实际生产工艺中上游发酵后的样品进行抗原及校准品的制备，所制备的校准品可以较为充分地反映实际生产工艺中的HCP，减少因抗原校准品种类不足导致的漏检以及定量不准确的风险。

宿主细胞蛋白（HCP）ELISA定制化开发平台需要具备完善的开发体系，可靠的技术平台，专业的开发团队，以实现长期稳定供应符合法规要求的试剂盒。其中校准品作为关键原材料，其良好的稳定性和溯源保障对生命周期至关重要。为确保校准品的稳定，一般采用冻干工艺制备校准品，用单因素方差分析方法对校准品进行均一性评估，采用法规规定的蛋白定量方法进行校准品的赋值，并溯源至国家标准品（如有）或BSA国家标准品。其次，由于HCPs是复杂的多分析物，为制备尽可能高覆盖率的抗体，覆盖工艺下特有的高风险HCPs，需采用可靠的免疫策略。得到符合性能要求的抗体后，需采用经过验证的可靠的2D或LC-MS方法进行抗体覆盖率的表征，以确保抗体可以充分覆盖各实际工艺下产生的HCPs。得到了具有代表性的抗原和性能优良的抗体后，便是ELISA检测体系的开发，主要包括原辅料的筛选和制备研究、各组分工艺及反应体系研究、稳定性研究等。在检测体系开发完成后，需要根据ICH及药典要求进行分析方法验证的评估，以确保整个检测体系的线性、范围、检测限、定量限、准确度、精密度、专属性以及耐用性等可以满足法规要求。

影响宿主细胞蛋白（HCP）残留检测结果的因素之一是样品质量。HCP检测贯穿生物制品生产的全过程，涉及收获、纯化、制备等多个步骤。在不同样品基质下，HCP检测可能存在巨大差异。例如，对于含有佐剂的疫苗，由于佐剂的干扰，难以在成品中对HCP项目进行检测，因此一般在吸附工艺之前的原液阶段进行检测。此外样品的收集、处理和保存方式对检测结果至关重要。不正确的处理可能导致蛋白降解或变性，从而影响检测结果。例如，若采用历史批样品作为内部质控品，应结合其稳定性数据合理制定保存条件及保存期限，以保证检测方法的准确性和稳定性。

LC-MS技术作为生物制品宿主细胞蛋白残留检测新趋势，需考虑以下几点：①稳定性：需要HCPs LC-MS检测流程进行验证，全流程都需要有严格的QC控制，确保检测结果的一致性和稳定性。②可重复性：不同类型生物制品中HCPs提取效率不同，不同人员操作存在差异，需要在上机前通过不同方法评估HCPs的提取效率，避免人为因素造成结果重复性差。③准确度：方法开发与验证阶段，通过设立内标与定量算法，根据内标响应回算得到HCPs的含量，确保定量结果的准确性。④抗干扰能力：高丰度蛋白和特殊基质会对质谱检测产生影响，需要通过前处理手段对高丰度蛋白或特殊的基质进行去除，以减少其对HCPs肽段在质谱检测时的影响。⑤真实性：样品中除HCPs以外的物质在质谱分析中同样会产生质谱信号，需要去除复杂的背景噪音避免假阳性和假阴性的出现，建立合理标准的生信分析流程。分析流程建立过程中同样需要建立严格的质控QC标准，并通过后期不同方法进行验证，确定其标准的真实性。