广东E.coli表达菌宿主细胞蛋白（HCP）残留检测常见问题分析

宿主细胞蛋白（HCP）作为生物制品中来源于细胞基质的残留杂质，具有明显的异质性特征。其复杂性体现在三个方面：①理化特性差异：HCP涵盖胞内及分泌蛋白，涉及关键生理功能，具有涵盖区间大的等电点（pI 3-11）、分子量范围（5-250kDa）及疏水性；②上游工艺影响：不同发酵工艺（如细胞株、培养条件）诱导独特的翻译后修饰（PTM），导致HCP总量与生化复杂性增加；③下游工艺与产物特性干扰：抗体、细胞因子等重组蛋白或病毒类药物的纯化工艺会选择性残留特定HCP，且产物形式（如大肠杆菌的包涵体/可溶性表达）直接影响HCP残留谱。针对特定生产工艺开发定制化检测方案是准确监控宿主细胞蛋白残留的关键。

湖州申科生物CHO-K1 HCP 残留检测试剂盒（一步酶联免疫吸附法）基于固相酶联免疫吸附分析法，适用于基于CHO-K1细胞生产的生物制品中宿主残留蛋白的定量检测。该分析方法通过在预包被抗CHO-K1HCPs绵羊多抗的酶标板中加入校准品或待测样品、HRP标记的抗CHO-K1HCPs绵羊多抗进行共孵育。洗涤后，加入TMB底物进行显色反应，再使用终止液终止酶催化反应。利用酶标仪在450nm波长下测读吸光度，其吸光度与校准品或待测样品中的HCPs浓度成正相关，通过校准品拟合的剂量-反应曲线即可计算得出待测样品中HCPs的浓度。本试剂盒对待测样品无需进行特殊处理，只需通过合适的稀释比例进行适用性验证即可直接使用。本试剂盒操作步骤少，快速，检测专一性强，性能稳定可靠。

湖州申科采用免疫磁珠分离（IMBS）结合 2D 电泳或者 LC-MS 的方法评估抗体覆盖率。IMBS主要流程包括多克隆抗体与磁珠偶联，磁珠未结合位点的封闭，HCP样本与结合抗体的磁珠共同孵育，此过程中 HCP 抗体结合可以识别的 HCP，而未识别的 HCP 则通过后续洗涤步骤去除，再通过低 pH等洗脱条件收集抗体捕获的HCP。该方法拥有 AAE(Antibody Affinity Extraction)免疫层析柱分离的所有优点，同时免疫磁珠可以在悬浮的条件下与 HCP样品充分混匀结合，HCP结合效果更佳，由于采用磁珠吸附可以减少 HCP与填料的非特异性吸附，提高实验准确性。

针对宿主细胞蛋白残留检测，工艺特异型检测试剂盒（upstream-process）专为特定生产工艺设计，其关键在于使用产物的实际宿主细胞进行开发与验证，模拟真实生产流程获取广谱HCP抗原，并要求抗血清具备高度覆盖率以适应工艺变动，确保对特定生产流程残留的高度准确监控。平台型检测试剂盒（platform）则由生产商针对其特定表达宿主细胞和相近工艺自行开发，其优势在于可使用相同的参考标准品和试剂统一监测在该宿主上生产的不同产品，适用于上游工艺足够相似的产品线。通用型检测试剂盒（commercial）则作为市售广谱方案，适用于相似宿主细胞的常规检测，但因其制备过程可能无法完全模拟目标产物的实际生产，必须严格评估多克隆抗体对特定产品HCP的覆盖率，以保证检测可靠性。三类试剂盒覆盖从深度定制到通用筛查的不同需求。

大肠埃希氏菌(Escherichia coli，E. coli)又称大肠杆菌，其作为模式微生物被广泛应用于生命科学研究中。随着基因治疗产业的大力发展，大肠杆菌也被主要应用于质粒DNA（pDNA）的生产。由于质粒样品的常见提取工艺中往往使用条件剧烈的碱溶液进行细胞裂解和蛋白质变性，使得其中的HCPs与传统物理破碎法获得的HCPs有较大的差异，导致其在采用免疫学原理的检测方法时，残留检测结果差别较大。湖州申科生物E.coli克隆菌碱裂HCP残留检测试剂盒用于大肠杆菌（又名大肠埃希菌）克隆菌株相关的HCPs检测，如DH5α、Top10、JM109等。在抗体制备时采用碱裂工艺制备的HCPs免疫动物，获得专门的抗体。适用于经碱液裂解工艺处理后的宿主细胞蛋白HCPs定量检测。

影响宿主细胞蛋白（HCP）残留检测结果的因素之一是方法选择。酶联免疫吸附法（ELISA法）和液相色谱-质谱联用方法（LC-MS法）是目前HCP检测的两大常用方法。文献统计显示，目前对于总HCP定量，ELISA仍是主流方法；MS法作为对特定蛋白（例如，高风险蛋白）的鉴定和定量，已成为重要的互补手段。此外检测过程中使用的试剂和耗材的质量直接影响检测结果的准确性。低质量的试剂可能导致假阳性或假阴性结果。例如，抗体的特异性和亲和力不足，可能导致ELISA检测中的交叉反应；抗原代表性不强或是抗体覆盖率低，可能会导致漏检；稀释液抗干扰能力弱，可能影响检测准确性。案例研究表明，采用定制化方法替代原有商业化试剂盒后，抗原代表性和抗体覆盖率明显提高，HCP检测值整体升高。