北京酿酒酵母宿主细胞蛋白（HCP）残留检测常见问题分析

为什么定制化试剂盒是宿主细胞蛋白残留检测的优先选择？原因之一是建立定制化检测体系，更满足商业化生产HCP工艺杂质控制要求。在HCP校准品和HCP抗体两大关键试剂组分满足要求的前提下，定制化方法的建立和优化是基于真实纯化中间品和原液样品进行，通过优化检测条件，提高对低浓度HCPs的检测灵敏度，满足工艺验证和过程控制要求。在临床三期，生产工艺需要进行系统验证，以确保其稳定性和可重复性。定制化HCP ELISA检测方法能够更准确地监测生产工艺中HCP的去除效果，为工艺验证提供有力支持。在过程控制中，通过工艺特异型的HCP ELISA检测方法，可以实时监测生产过程中的HCP水平，具备更强的生产异常预警能力，及时发现生产风险，确保产品质量的稳定性。

湖州申科生物结合不同宿主实际的生产工艺，通过高质量免疫原和 HCP 多抗的标准化制备流程，获得高效价、高覆盖率的抗体，开发了适用于大肠杆菌表达菌 (BL21) 生产工艺、克隆菌碱裂法提取质粒工艺的 SHENTEK®E.coli HCP检测试剂盒， 适用于CHO\MDCK\HEK293\Sf9\VERO\毕赤酵母等不同宿主的 HCP 检测试剂盒。用于中间品、原液及终产品等的HCP定量监测。为确保 ELISA 对HCP定量检测的准确性，须对 HCP 抗体覆盖率进行验证。湖州申科抗体覆盖率平台采用2D Clean-up 试剂盒去除蛋白样品的干扰物（洗涤剂、盐、脂质、酚类和核酸等离子污染物），并设置2D 质控标准品进行严格质控，同时以阴性抗体为对照平行试验，以提高结果准确度。

大肠埃希氏菌(Escherichia coli，E. coli )又称大肠杆菌，其作为模式微生物被广泛应用于生命科学研究中。大肠杆菌是表达药用异源蛋白的常用微生物，在被批准的药用蛋白中，大约30%的产品以大肠杆菌作为表达宿主菌。与其他表达平台一样，尽管下游复杂的纯化步骤已经去除了大量的杂质，但终产品中仍会存在HCP残留风险，必须对其进行质量控制，使其符合放行标准。湖州申科生物E.coli表达菌HCP残留检测试剂盒用于大肠杆菌表达菌株BL21来源的宿主细胞蛋白定量检测，适用于重组蛋白类产品的工艺中间品和原液类样品，如白细胞介素（IL）、干扰素（rhIFN）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、肿瘤坏死因子（rhTNF）、促生长因子（EGF/FGF/PDGF）等。试剂盒检测步骤少，快速，专一性强，性能稳定可靠。

宿主细胞蛋白残留检测抗体覆盖率评估：法规推荐的方法有两大类：一类是传统2D-WB法，另一类是基于抗体亲和的免疫捕获类方法。传统2D-WB法存在需要蛋白变性，样品需要前处理（破坏蛋白天然表位）；转膜效率低；易产生非特异性等缺陷，难以反映真实的覆盖率水平。湖州申科自主开发了免疫磁珠捕获分离技术（immunomagnetic beads separation，IMBS)，利用免疫磁珠的半液态性质，可以在悬浮的条件下与HCP样本充分混匀结合，整个过程蛋白无需变性，结合方式与ELISA检测条件相似，可以获得更真实的覆盖率结果。

宿主细胞蛋白残留检测抗体覆盖率评估实验操作复杂，需要在建立实验方法阶段对关键步骤进行充分的验证，以证明实验方法的稳健性。湖州申科开发的基于磁珠捕获的IMBS方法（immunomagnetic beads separation），在开发过程中对关键步骤进行了充分验证,相关结果经过专业评审，验证的内容如下（部分）：①方法优化：针对磁珠与抗体的偶联比例、洗涤液体积、洗涤次数、洗脱次数等关键参数进行优化验证，以保证方法的稳健性；②过程质控：二维电泳存在实验步骤多，时间跨度长，中间步骤难以控制等缺陷，因此在等电聚焦实验部分设计了荧光标记多肽，可快速判断等电聚焦效果。在SDS-PAGE电泳的两侧增加40 ng银染质控，用于银染显色的控制；③方法重复性：针对2D分析以及LC-MS分析进行重复性确认，其中2D分析方法重复性可达到80%以上，LC-MS分析方法可到90%以上；④上样量优化：针对2D分析以及LC-MS分析进行上样量确认，消除上样量差异对检测结果带来的影响；⑤假阳性：排除样品与阴性抗体之间是否存在非特异性结合，确定IMBS实验所设定的步骤、参数是否有假阳性结果存在。

宿主细胞蛋白来源中往往同时存在核酸，胞膜脂类，培养基中的氨基酸等非HCP成分会干扰总蛋白的检测准确性，需要在检测之前进行纯化前处理，同时对总蛋白检测方法进行方法学确认。HCP是一种多蛋白质的混合物，总蛋白定量方法之间检测结果会存在一定程度的差异，这也是导致HCP免疫检测方法结果差异的原因之一。若HCP蛋白定量方法间检测结果差异较大，一般同时采用2种以上经过确认的方法检测，再取均值。总蛋白检测方法的定量限一般只能达到μg/mL水平,但是HCP检测试剂盒的产品校准品在ng/mL水平。从HCP高浓度原液稀释到低浓度产品校准品中存在稀释误差，需要对产品校准品进行重新标定赋值。