重庆热原检测欧盟出口方案

中国药典对 MAT 法热原检测要求 4 复孔，未明确 CV 限值，需结合细胞实验特性合理解读与操作。药典不设 CV 限值的主要原因是：MAT 法基于细胞反应，细胞活性易受环境微小变化（如温度、pH）影响，存在天然不稳定性，过严的 CV 要求可能脱离实际；但实验室可通过积累多批次数据，制定内部 CV 控制范围（如定量上下限 CV≤30%、25%），确保检测重复性。关于 3 复孔的适用性：若长期数据显示 CV 控制良好（如连续 10 批次 CV<20%），且样品为中间过程检测（非 QC 放行），可尝试 3 复孔，但需同步设置加标对照，验证结果可靠性；若为 QC 放行检测，仍建议按 4 复孔操作，符合药典下限要求。对于异常点处理，可采用狄克逊准则（Q 检验）等统计学方法 —— 如某复孔 IL-6 检测值偏离平均值 30% 以上，且无明显操作误差（如加样错误），可判定为异常点并剔除，但需在原始记录中详细说明原因，确保数据可追溯，避免随意剔除导致结果失真。

MAT 法热原检测中，细胞传代的代次控制是保障检测稳定性的关键，需结合细胞特性与文献数据制定标准。参考行业文献，单核细胞系（如 HL-60、THP1）的使用代次通常不超过 20 代，代次过高会导致细胞生物学特性改变：一是 TLR 受体表达下降，如 TLR4 表达量在 20 代后下降 40%，导致内毒素检测灵敏度降低；二是细胞倍增时间延长，从 24 小时延长至 36 小时，影响共培养时长的准确性；三是炎症因子分泌减少，IL-6 分泌量在 20 代后下降 35%，导致热原浓度低估。申科对配套的 HL-60 细胞系进行代次稳定性验证，结果显示：1-15 代细胞的热原响应性一致（加标回收率 85%-125%），16-20 代回收率波动至 70%-130%，21 代后回收率 < 70%，因此建议控制在 1-15 代使用。实验室需建立细胞代次记录制度，每传代 1 次记录代次，达到 15 代后及时更换新批次细胞，并验证新批次细胞与旧批次的一致性（如检测同一样品，结果偏差≤20%），确保不同代次细胞的检测结果稳定。

随着发热反应分子机制研究的不断深化，单核细胞活化试验（MAT）作为一种体外热原检测技术，愈发受到医药与医疗器械行业的关注并逐步推广应用。该方法的原理是：让人体全血与待检样品中的热原充分接触后，通过检测体系中产生的 IL-1β、IL-6（因稳定性强、重复性优，常作为关键检测指标）、TNF 等促炎细胞因子含量，实现对热原污染程度的评估，整个过程能高度模拟人体先天免疫系统对热原的应答反应。相较于传统热原检测手段，MAT 的优势更为突出：不仅可检出各类热原污染物，包括尚未明确性质的未知热原，以及革兰氏阳性菌（脂磷壁酸）、真菌、病毒等产生的非内毒素热原，填补了传统内毒素检测（如鲎试剂法）的覆盖空白。此外，MAT 无需使用实验动物，契合全球 “替代、减少、优化”（3R 原则）的监管导向，目前已被《欧洲药典》等法规列为家兔热原试验的替代方法，进一步提升了其在合规检测中的适用性。

热原是指微量即可引发恒温动物体温异常升高的物质，分为内源性（如细胞因子）与外源性两类，外源性热原又涵盖微生物来源（革兰氏阴性菌脂多糖 LPS、革兰氏阳性菌脂磷壁酸 LTA、病毒、真菌等）与非微生物来源（灰尘、橡胶降解产物等）。传统细菌内毒素检查法（BET）只能检测革兰氏阴性菌的 LPS，无法覆盖非内毒素热原，而单核细胞活化试验（MAT）可弥补这一缺陷。其原理是：热原通过活化单核细胞表面的 Toll 样受体（TLR，如 TLR4 识别 LPS、TLR2/TLR6 识别 LTA），启动先天免疫反应，促使细胞释放 IL-6、TNF-α 等促炎细胞因子；随后采用 ELISA 法检测 IL-6 浓度，结合 LPS 标准曲线推算样品中总热原含量，实现对内毒素与非内毒素热原的同步检测，契合《中国药典》9301 指导原则中 全场景防控热原风险”的要求。

热原检测MAT法的法规地位持续提升，已成为多国药典认可的热原检测替代方法。欧洲药典（EP）是推动 MAT 应用的关键力量：通则 2.6.30 明确 MAT 可替代家兔热原试验（RPT），且能同时检测内毒素与非内毒素热原；2024 年欧洲药典委员会批准删除所有条款中的家兔法，修订文本将于 2025 年7月1日生效，强制鼓励使用 MAT 等体外替代方法。美国药典（USP）<151> 规定，经验证的体外热原试验（如 MAT）可替代家兔法，且需依据 USP<1225>开展验证；FDA 行业指南进一步明确 MAT 的合规性。中国药典 2020 年版通则 9301 将 MAT 列为热原检查的补充方法，虽暂未替代家兔法，但明确其适用于复杂基质样品的全热原筛查。此外，ISO 10993-1、ICCVAM 等国际标准也优先推荐体外热原检测模型，全球法规协同推动 MAT 成为热原检测的主流技术。

MAT 法热原检测的关键机制是 “热原活化单核细胞 TLR 受体，触发炎症因子分泌”，TLR 受体的全覆盖是保障检测无遗漏的关键。不同热原需活化不同 TLR 受体：最常见的内毒素（LPS）主要活化 TLR4，而革兰氏阳性菌的非内毒素热原（如脂磷壁酸）需活化 TLR2/6，真菌多糖活化 TLR2/4，病毒核酸活化 TLR3/7/8 等。因此，MAT 试剂盒配套细胞需具备全覆盖的 TLR 受体表达—湖州申科生物通过 Western blot 验证，其 HL-60 细胞系表达 TLR1-TLR9，可响应各类热原。为进一步验证覆盖能力，申科用不同非内毒素热原配体（如脂磷壁酸、酵母多糖）刺激细胞，结果显示所有配体均能诱导 IL-6 分泌，且呈良好量效关系，证明试剂盒可检出各类热原。若细胞 TLR 受体覆盖不全（如缺失 TLR2），则无法检测革兰氏阳性菌的非内毒素热原，导致漏检风险，因此 TLR 受体的全覆盖是 MAT 法热原检测的关键技术指标之一。