上海血液制品热原检测欧盟出口方案

湖州申科生物MAT试剂盒配套的即用型细胞，需严格遵循解冻与使用规范，避免细胞活性下降影响热原检测结果。首先，解冻操作需快速：从液氮罐或 - 80℃冰箱取出细胞后，立即放入 37℃水浴锅快速解冻（约 1-2 分钟），避免缓慢解冻导致细胞内形成冰晶，损伤细胞膜；解冻后需立即取出，用 75% 酒精擦拭管外壁消毒，防止污染。其次，细胞解冻后需一次性使用完毕，不建议按量添加培养基或添加剂后分次使用—即用型细胞经工艺优化，活性与浓度已预调，分次使用会导致细胞状态不均（如部分细胞活化、部分休眠），影响热原反应性。使用时需严格按说明书操作：将解冻后的细胞直接加入含样品的微孔板中，无需额外洗涤或稀释，若样品为高浓度基质，可提前用无热原培养基稀释样品（不超 MVD），但细胞不可稀释。此外，解冻后的细胞需在 30 分钟内完成加样，避免室温放置过久导致细胞活性下降，若无法及时加样，需置于 37℃培养箱暂存，但不超过 1 小时，确保细胞用于热原检测时处于较好的活性状态。

PyroSHENTEK^®热原检测试剂盒依据 ICH Q2 (R2)、《中国药典》（如通则 9301）及欧洲药典（EP 2.6.30）要求，完成了线性、范围、定量限、准确度、精密度、耐用性等全维度性能验证。线性方面，0.0125-1.0EU/mL范围内拟合良好，R²≥0.98；准确度通过加标回收实验验证，不同样品基质（如生物制品、化学制药原料）的回收率均落在 50%-200% 区间；精密度表现优异，批内与批间 CV 均≤15%，且无论是 3 复孔还是 4 复孔检测均能达标。此外，试剂盒使用中国药典推荐的 MAT 特定标准品，可直接用于国内外申报，契合全球 “3R 原则” 监管导向—尤其适配《欧洲药典》删除家兔法、《美国药典》鼓励 MAT 替代等新法规趋势，为企业应对不同地区的热原检测合规要求提供有力支持。

MAT 法热原检测标曲采用非倍比稀释，而非 1-0.5-0.25 的倍比稀释，主要优势在于提升标曲准确性与适用性，避免稀释误差影响。一是可密集覆盖关键浓度区间：热原检测的重点关注区为低浓度拐点（如 0.0125-0.1EU/mL）与高浓度平台区（如 0.5-1EU/mL），非倍比稀释可在这些区间设置更多浓度点（如 0.0125、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1EU/mL），提升曲线拟合精度，而倍比稀释低浓度点少，易导致低浓度热原定量不准。二是降低稀释误差累积：倍比稀释需连续稀释（如 1EU/mL→0.5EU/mL→0.25EU/mL），每一步误差会累积，导致低浓度点实际浓度偏离理论值；非倍比稀释通过单独配制每个浓度点（如直接用标准品配制 0.025EU/mL），避免误差累积，提升标曲可靠性。三是适配不同样品浓度：非倍比稀释可根据样品预期浓度调整标曲范围，如样品预期浓度 0.05EU/mL，可增加 0.025、0.05、0.1EU/mL 点，确保样品浓度落在标曲线性区，而倍比稀释范围固定，灵活性差。这些优势使非倍比稀释成为 MAT 法标曲配制的优先选择方式。

热原是指微量即可引发恒温动物体温异常升高的物质，分为内源性（如细胞因子）与外源性两类，外源性热原又涵盖微生物来源（革兰氏阴性菌脂多糖 LPS、革兰氏阳性菌脂磷壁酸 LTA、病毒、真菌等）与非微生物来源（灰尘、橡胶降解产物等）。传统细菌内毒素检查法（BET）只能检测革兰氏阴性菌的 LPS，无法覆盖非内毒素热原，而单核细胞活化试验（MAT）可弥补这一缺陷。其原理是：热原通过活化单核细胞表面的 Toll 样受体（TLR，如 TLR4 识别 LPS、TLR2/TLR6 识别 LTA），启动先天免疫反应，促使细胞释放 IL-6、TNF-α 等促炎细胞因子；随后采用 ELISA 法检测 IL-6 浓度，结合 LPS 标准曲线推算样品中总热原含量，实现对内毒素与非内毒素热原的同步检测，契合《中国药典》9301 指导原则中 全场景防控热原风险”的要求。

生物制品（如单克隆抗体、重组蛋白、细胞因子）因基质成分复杂（含高浓度蛋白质、螯合剂、表面活性剂、缓冲盐等），在热原检测过程中易出现“反应抑制”或“非特异性增强”现象，严重影响检测结果准确性。选择抗干扰能力更强的检测方法至关重要，重组级联试剂（rCR）因采用完整级联反应路径，抗干扰性优于天然 LAL；单核细胞活化反应测定（MAT）对复杂基质耐受性更高，通过适当稀释即可消除多数干扰，因此生物制品热原检测常采用 “rCR 法（内毒素定量）+ MAT 法（全热原筛查）” 的联合方案，既保证内毒素检测的准确性，又防控非内毒素热原风险。