四川医疗器械热原检测

MAT法热原检测出现 “无信号”，需从试剂、实验操作、仪器三方面定位原因并解决。试剂层面，抗体不足或失活会导致无法捕获 IL-6，需核对抗体稀释比例，检查保存条件（如 2-8℃）与有效期，必要时更换试剂；底物失效（如变色、沉淀）会无法显色，需观察底物外观，失效则更换；混合不同试剂盒试剂会因成分不匹配导致反应失败，需使用同试剂盒试剂；ELISA 试剂盒保存不当（如反复冻融）会破坏试剂活性，需按说明书分条件保存（如抗体 2-8℃、底物避光）。实验操作中，孵育温度过低（<37℃）会抑制酶促反应，需提前将试剂与孔板平衡至室温，确保孵育温度达标；洗板机压力过高或手动洗涤过猛，会洗去结合的抗体与酶，需调整洗板机压力或轻柔手动洗涤；孵育时孔板未密封导致孔变干，会使反应体系破坏，需用封口膜密封孔板。仪器方面，洗板机喷头堵塞会导致洗涤不均或未洗，需清理喷头；酶标仪波长设置错误（未选 450nm）会无法检测信号，需确认波长设置正确。

湖州申科生物MAT试剂盒配套的即用型细胞，需严格遵循解冻与使用规范，避免细胞活性下降影响热原检测结果。首先，解冻操作需快速：从液氮罐或 - 80℃冰箱取出细胞后，立即放入 37℃水浴锅快速解冻（约 1-2 分钟），避免缓慢解冻导致细胞内形成冰晶，损伤细胞膜；解冻后需立即取出，用 75% 酒精擦拭管外壁消毒，防止污染。其次，细胞解冻后需一次性使用完毕，不建议按量添加培养基或添加剂后分次使用—即用型细胞经工艺优化，活性与浓度已预调，分次使用会导致细胞状态不均（如部分细胞活化、部分休眠），影响热原反应性。使用时需严格按说明书操作：将解冻后的细胞直接加入含样品的微孔板中，无需额外洗涤或稀释，若样品为高浓度基质，可提前用无热原培养基稀释样品（不超 MVD），但细胞不可稀释。此外，解冻后的细胞需在 30 分钟内完成加样，避免室温放置过久导致细胞活性下降，若无法及时加样，需置于 37℃培养箱暂存，但不超过 1 小时，确保细胞用于热原检测时处于较好的活性状态。

家兔热原试验作为热原检测领域的 “法定传统方法”，被中国药典（ChP）、美国药典（USP）、欧洲药典（EP）均列为法定检测项目，其主要优势在于可通过家兔体温应答筛查所有类型热原，尤其适用于无法排除非内毒素热原污染的高风险产品，如血液制品、放射性质药物及部分生物制剂。然而，家兔热原试验存在明显局限：动物个体差异大，需额外投入时间与成本筛选合格家兔；检测周期长（至少 6 小时），无法满足生物制品快速放行需求；灵敏度较低（对 LPS 检测限≥5EU/kg），与全球倡导的“动物福利3R原则”背道而驰。

热原是指微量即可引发恒温动物体温异常升高的物质，分为内源性（如细胞因子）与外源性两类，外源性热原又涵盖微生物来源（革兰氏阴性菌脂多糖 LPS、革兰氏阳性菌脂磷壁酸 LTA、病毒、真菌等）与非微生物来源（灰尘、橡胶降解产物等）。传统细菌内毒素检查法（BET）只能检测革兰氏阴性菌的 LPS，无法覆盖非内毒素热原，而单核细胞活化试验（MAT）可弥补这一缺陷。其原理是：热原通过活化单核细胞表面的 Toll 样受体（TLR，如 TLR4 识别 LPS、TLR2/TLR6 识别 LTA），启动先天免疫反应，促使细胞释放 IL-6、TNF-α 等促炎细胞因子；随后采用 ELISA 法检测 IL-6 浓度，结合 LPS 标准曲线推算样品中总热原含量，实现对内毒素与非内毒素热原的同步检测，契合《中国药典》9301 指导原则中 全场景防控热原风险”的要求。

MAT 法与传统家兔法在热原检测中，性能差异明显，MAT 法在准确性、效率与合规性上更具优势。从结果评判来看，MAT 法以 “加标回收率 50%-200%、供试品浓度 < 规定限值（CLC）” 为合格标准，灵敏度达 0.0125EU/mL，可准确定量热原浓度；而家兔法只能定性（观察体温升高），灵敏度低（约 0.1-0.5EU/mL），易因家兔个体差异（如免疫状态、应激反应）导致假阴性。从检测效率来看，MAT 法样品与细胞共培养 24 小时即可出结果，且可批量检测（96 孔板一次处理多个样品）；家兔法需连续观察 72 小时，每次只能检测少量样品，耗时且人力成本高。从合规性来看，MAT 法不使用动物，符合 3R 原则，已被欧盟接受（EP 删除家兔法）；家兔法因动物实验属性，面临欧盟等地区的法规限制。此外，MAT 法重复性优（复孔 CV 可控制在 30% 以内），家兔法因个体差异 CV 常超 50%，进一步凸显 MAT 法在现代热原检测中的优势。