江苏生物制品热原检测常见问题分析

MAT法热原检测中，ELISA 加终止液后的读数时间需严格控制，以保障 IL-6 检测信号稳定。湖州申科生物MAT试剂盒说明书明确要求，终止液添加后需在 10 分钟内完成读数，且需避光操作 —— 原因在于，终止液（如硫酸）会终止 TMB 显色反应，但生成的黄色产物在光照下易降解，超过 10 分钟后 OD 值会下降，导致 IL-6 检测值偏低。读数前需进行 30 秒震荡混匀，确保孔内液体浓度均匀，避免因局部浓度差异导致复孔 OD 值波动。酶标仪波长需设置为 450nm，若仪器含 600nm 参考波长，可同时检测 600nm 波长以扣除背景干扰（如细胞碎片导致的光散射），提升检测准确性。需注意的是，读数时不可覆盖封板膜或盖子，避免膜上凝结的水蒸气滴入孔中，导致 OD 值异常升高。若因仪器故障无法及时读数，需将微孔板密封后置于 4℃避光保存，并在 30 分钟内完成读数，同时在记录中注明延迟原因，评估延迟对结果的影响（如延迟 20 分钟，OD 值可能下降 15%，需校正后使用）。

MAT 法热原检测的关键机制是 “热原活化单核细胞 TLR 受体，触发炎症因子分泌”，TLR 受体的全覆盖是保障检测无遗漏的关键。不同热原需活化不同 TLR 受体：最常见的内毒素（LPS）主要活化 TLR4，而革兰氏阳性菌的非内毒素热原（如脂磷壁酸）需活化 TLR2/6，真菌多糖活化 TLR2/4，病毒核酸活化 TLR3/7/8 等。因此，MAT 试剂盒配套细胞需具备全覆盖的 TLR 受体表达—湖州申科生物通过 Western blot 验证，其 HL-60 细胞系表达 TLR1-TLR9，可响应各类热原。为进一步验证覆盖能力，申科用不同非内毒素热原配体（如脂磷壁酸、酵母多糖）刺激细胞，结果显示所有配体均能诱导 IL-6 分泌，且呈良好量效关系，证明试剂盒可检出各类热原。若细胞 TLR 受体覆盖不全（如缺失 TLR2），则无法检测革兰氏阳性菌的非内毒素热原，导致漏检风险，因此 TLR 受体的全覆盖是 MAT 法热原检测的关键技术指标之一。

中国药典与欧洲药典对 MAT 热原检测的细胞类型及复孔数有明确要求，且存在细节差异。细胞类型上，两者均认可人全血、PBMC（外周血单个核细胞，至少 4 个供体，欧洲药典建议 8 个供体），中国药典明确将单核细胞系纳入，欧洲药典则要求单核细胞系需做支原体污染检测、细胞鉴别等；检测方法均为 “热原刺激细胞 + ELISA 检测 IL-6/IL-1β/TNF-α”。复孔数方面，两者均规定平行孔≥4、浓度点≥4，中国药典额外要求标曲 r≥0.90，主要目的是通过多重复孔抵消 PBMC 的不稳定性，确保热原检测结果准确可靠。

家兔热原试验作为热原检测领域的 “法定传统方法”，被中国药典（ChP）、美国药典（USP）、欧洲药典（EP）均列为法定检测项目，其主要优势在于可通过家兔体温应答筛查所有类型热原，尤其适用于无法排除非内毒素热原污染的高风险产品，如血液制品、放射性质药物及部分生物制剂。然而，家兔热原试验存在明显局限：动物个体差异大，需额外投入时间与成本筛选合格家兔；检测周期长（至少 6 小时），无法满足生物制品快速放行需求；灵敏度较低（对 LPS 检测限≥5EU/kg），与全球倡导的“动物福利3R原则”背道而驰。

在单核细胞活化试验（MAT）的热原检测中，IL-6 被确定为关键检测指标，而非 IL-1β 或 TNF-α，主要源于其在稳定性、生物学关联性及商业化应用上的优势。从稳定性来看，IL-6 在体外培养环境中受个体免疫状态影响较小，半衰期更长，实验重复性更优，且检测灵敏度高，能准确定量热原污染水平；而 TNF-α 和 IL-1β 产生时间短、表达量低，还易被蛋白酶降解，导致检测信号波动大，难以标准化。从生物学特性而言，IL-6 是先天免疫反应的炎症介质，可通过活化 JAK-STAT 和 NF-κB 通路驱动急性期反应，如诱导大脑产生前列腺素 E2（PGE2）触发发热，与热原的致热机制直接关联，是公认的发热标志物。同时，MAT 法热原检测会辅以 IL-1β 和 TNF-α 监测 ——IL-1β 反映单核细胞活化程度，TNF-α 提示炎症放大效应，形成多因子协同体系。此外，IL-6 的 ELISA 试剂盒市场成熟度高、跨平台兼容性强，而 IL-1β 和 TNF-α 的检测方法在灵敏度和标准化上仍有局限，进一步奠定了 IL-6 的重要地位。

热原是能引发恒温动物体温异常升高的物质总称，主要成分为细菌内毒素（革兰氏阴性菌脂多糖 LPS），同时涵盖病毒、真菌毒素、支原体等非内毒素热原，其检测是保障药品与医疗器械安全性的关键环节。当前热原检测已形成 “特异性检测 + 广谱筛查” 互补的完整体系：以鲎试验法（含天然 LAL 与重组 rCR/rFC 试剂）作为细菌内毒素的特异性检测手段，凭借 fg 级灵敏度成为制药行业常规质控方法，可通过凝胶法实现定性、动态浊度 / 显色法完成定量；以家兔热原试验作为传统广谱筛查方法，虽操作繁琐（需预试筛选基础体温稳定家兔，正式试验观察 3 小时体温变化），但仍是放射性质的药物、血液制品等高风险产品排除非内毒素热原的补充手段；以单核细胞活化反应测定（MAT）作为新兴全热原检测技术，利用人源单核细胞（如 THP-1 细胞）释放 IL-6、TNF-α 等细胞因子的特性，可同时识别内毒素与非内毒素热原，契合疫苗、基因治疗产品等对风险控制的需求。三种方法协同应用，从原料入厂到成品放行构建全流程热原防控网络，既保证对内毒素的准确监控，又避免非内毒素热原的遗漏风险。