重组蛋白内毒素检测方法验证

内毒素检测鲎试剂的反应受pH的干扰。在进行检测时，要调节被测溶液的pH值，使鲎试剂与供试品溶液的混合溶液pH值落在鲎试剂指定的使用pH范围内（一般鲎试剂作用pH值在6.0~8.0范围内)。用于调节pH值的试液或溶液（酸或碱)，可采用BET用水配制，并将溶液在无热原容器中储存；必须对试液或溶液进行验证，以证明不含可检出的内毒素并且无干扰因素。调节pH试剂（酸或碱）的添加量，不应该超过供试品的1092。如果超过10%，则在进行计算时，将DH试剂的添加量的系数计算进去。

在开展内毒素检测时，样品的 pH 值与二价离子（Mg²⁺、Ca²⁺）水平是影响鲎试剂酶促反应的关键因素，直接关系检测结果的准确性。鲎试剂检测内毒素依赖丝氨酸蛋白酶的级联放大反应，该反应的合适 pH 值范围为 6.0-8.0，若样品过酸或过碱，会快速降低酶活性，甚至导致酶彻底失活，进而出现内毒素检测假阴性。针对这一问题，可使用 0.1N 或更低浓度的 HCl/NaOH 溶液，将样品 pH 值准确调节至适宜区间，为反应提供稳定环境。同时，二价离子是反应必需的辅助因子：Mg²⁺是内毒素活化鲎试剂的关键，缺乏会直接阻断反应启动；Ca²⁺虽参与酶促反应，但浓度过高会反向抑制反应效率。若样品中含有肝素钠、EDTA、柠檬酸钠等螯合剂，会与二价离子结合导致其浓度不足，此时可通过内毒素检查用水稀释样品降低螯合剂浓度，或添加特定二价离子试剂补充，但需严格控制离子浓度，避免过度增强反应引发误差，确保内毒素检测能真实反映样品中的内毒素残留量。

低内毒素回收（LER）的主要形成机制之一是螯合剂与非离子表面活性剂的协同作用，直接影响内毒素检测结果。第一步，样品中的螯合剂（如柠檬酸盐）会去除二价阳离子（Mg²⁺、Ca²⁺），削弱 LPS 聚集体的盐桥结构，降低其刚性；第二步，表面活性剂（如吐温 20）嵌入 LPS 分子，形成混合聚集体（胶体、层状结构），改变 LPS 的超分子形态。LPS 从 “可检测态” 转为 “不可检测态”，导致鲎试剂中的 C 因子无法与内毒素结合，内毒素检测出现假阴性。这种变化是时间依赖的，与稀释度无关，给常规内毒素检测带来独特挑战。

动态显色法鲎试剂是湖州申科生物针对生产过程监控开发的内毒素检测工具，兼具准确性和便利性。该试剂灵敏度达 0.005-5EU/mL，标准曲线 R²≥0.990，可准确定量内毒素浓度，满足生物制品中间品和成品的放行需求。成套包装设计包含内毒素标准品、检查用水、主试剂复溶液、主反应试剂、96 孔板及封口膜，无需额外采购辅料，开箱即可使用，减少耗材浪费。稳定性上，批次间 CV 值≤15%，优于行业 20% 的平均水平，确保长期检测数据的一致性。配套抗增液可有效应对蛋白质、多糖等基质干扰，加标回收率稳定在 80%-120%。操作上适配主流酶标仪，支持 405nm 动态读数，数据可自动记录追溯，符合 GMP 数据完整性要求。

2024年7月26日，《美国药典》微生物委员会正式宣布，将第<86>章“使用重组试剂的细菌内毒素测试”纳入（USP-NF），该标准定于2025年5月正式生效。这一重要举措不仅标志着细菌内毒素检测领域从此正式迈入非动物源试剂的崭新发展阶段，更契合了全球生命科学领域遵循的3R原则（即通过非动物源技术替代动物实验、减少实验动物使用量、优化实验流程以降低动物痛苦）。此前传统细菌内毒素检测多依赖从鲎血中提取的试剂，而鲎作为海洋濒危“活化石”，其资源保护与检测需求间的矛盾长期存在；如今重组级联试剂（rCR）凭借技术创新成功替代传统鲎血，在有效守护蓝血鲎的生态未来、缓解资源依赖困境的同时，也为药品生产中的内毒素质量控制和用药安全保障，提供了更先进、更稳定且具备长期可持续性的解决方案。

湖州申科建立了标准化的低内毒素回收（LER）技术服务流程，全周期支撑内毒素检测优化：7 个自然日内完成客户沟通与 LER 确认，用天然鲎、重组鲎等方法检测并出具报告；60 个自然日开展方法开发，分析 LER 成因（如螯合剂、蛋白质 IP）并研究去掩蔽方案；30 个自然日进行 HTS 验证，完成 3 批 LER 实验与干扰实验，交付稳定试剂盒、操作规程及培训；再协助方法转移与 cGMP 验证。流程每环节均围绕内毒素检测展开，确保企业高效解决 LER 问题，满足法规要求。