北京抗体药物内毒素检测低内毒素回收

生物制品（如单抗、疫苗、重组蛋白）注射剂因直接进入人体，对细菌内毒素残留限值要求严苛（通常≤0.5 EU/mg 或更低），检测面临基质复杂、干扰物质多等挑战。样品中常见的蛋白质、螯合剂、表面活性剂等可能抑制或增强 LAL 反应，需通过预处理消除干扰：如采用稀释法降低基质浓度、添加中和剂（如 Mg²⁺）修复反应体系，或使用热灭活去除蛋白类干扰物。此外，生物制品生产全流程需进行内毒素监控，从细胞培养上清、纯化中间品到终产品均需检测，确保工艺去除内毒素的有效性，符合 ICH Q6B 等法规对 “关键质量属性” 的控制要求。

内毒素检测方法易受样品基质干扰，法规要求在方法应用前必须进行干扰验证，选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度，作为供试品干扰试验种添加的内毒素浓度计算回收率，若回收率在 50%-200% 范围内，表明无明显干扰；若回收率异常，需通过过滤、中和、透析、加热处理等方式优化样品前处理。方法学确认还需涵盖线性范围（如 0.005-5 EU/mL）、精密度（批内 CV≤15%）、检测限（LOD≤0.01 EU/mL）等指标，确保方法在实际样品检测中稳定可靠，符合《美国药典》 <85>、《中国药典》通则 1143 等药典要求。

细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁外膜释放的脂多糖（LPS）成分，具有极强的生物活性，微量即可引发人体发热、休克甚至多脏器功能衰竭。因此，在生物制品、医疗器械、制药用水等领域，细菌内毒素检测是保障产品安全性的关键质控环节。其检测原理基于内毒素与特定试剂的特异性反应：内毒素可活化鲎血变形细胞裂解物（LAL）中的凝血级联反应，通过C因子通路触发酶促反应，通过观察凝胶形成、浊度变化或显色强度实现定量或定性分析。目前，各国药典均将内毒素检测列为强制要求，以降低临床应用中的热原风险。

湖州申科生物重组级联试剂（rCR）采用基因工程技术合成，完全模拟了天然鲎试剂中的酶促级联放大反应。重组鲎试剂反应体系中包含重组C因子、重组B因子和重组凝固酶原。当供试品中存在内毒素，重组C因子识别内毒素后活化，会依次级联活化下游重组B因子和重组凝固酶原。凝固酶原转化为具有生物活性的凝固酶后，识别并催化下游带显色基团的底物产生显色反应。显色反应的强度和内毒素浓度成正相关，从而定量检测内毒素。本产品用于定量测定人用和动物用注射药物、生物制品及医疗器械等样品中的细菌内毒素的含量。

内毒素检测中，样品中的蛋白质或酶的修饰作用易破坏鲎试剂的反应体系，导致检测结果失真。鲎试剂检测内毒素的本质是一系列丝氨酸蛋白酶的酶促放大过程，若样品中存在氧化剂、抗氧化剂、蛋白水解剂或专一失活剂，会直接灭活反应所需的酶；而乙醇、苯酚等物质则会导致蛋白质变性，同样抑制反应进程。例如，某些生物制品中含有的蛋白水解酶，可能提前降解鲎试剂中的蛋白酶，使内毒素无法被正常检测。为消除这类干扰，需优先限制样品中抑制物的含量：可采用内毒素检查用水稀释样品，降低抑制物浓度；对耐热的抑制物（如部分蛋白水解酶），可通过加热灭活处理（如 56℃孵育 30 分钟）破坏其活性；若样品基质复杂，还可使用超滤技术分离内毒素与干扰蛋白质，避免修饰作用对酶促反应的影响，保障内毒素检测结果的可靠性。

实验数据充分证明，内毒素检测重组级联试剂（rCR）与天然鲎试剂的检测结果具有高度等效性，可实现方法无缝切换。对细胞培养辅料、冻干甲型肝炎疫苗、单抗 A/B 等 8 类代表性样品的平行检测显示，rCR 的检测平均值为 0.001-0.026EU/mL，天然鲎试剂为 0.002-0.034EU/mL，两者偏差≤0.003EU/mL。加标回收率方面，rCR 为 70%-175.4%，天然鲎试剂为 82.2%-156.6%，均处于 50%-200% 的合格范围。批内精密度上，rCR 的 CV 值为 0.524%-14.716%，天然鲎试剂为 0.908%-12.348%，均满足法规对精密度的要求。这种等效性确保了实验室在切换至重组试剂时，历史数据和工艺控制标准的连续性，降低方法转换风险。