上海医疗器械热原检测技术升级

单核细胞系培养的高度可控性，为热原检测结果的可靠性提供关键保障。其培养基配方（如营养成分、血清浓度）可定制，确保细胞获取充足营养；培养环境（37℃、5% CO₂、湿度≥90%）可恒定控制，维持细胞好的活性与 TLR 受体表达水平，避免因环境波动导致细胞功能异常。这种可控性还能防止细胞遗传突变与外源污染（如支原体、病毒），确保不同批次单核细胞系的热原响应一致性，让热原检测结果批间差异小，符合 GMP 对检测方法稳定性的要求。

热原是能引发恒温动物体温异常升高的物质总称，主要成分为细菌内毒素（革兰氏阴性菌脂多糖 LPS），同时涵盖病毒、真菌毒素、支原体等非内毒素热原，其检测是保障药品与医疗器械安全性的关键环节。当前热原检测已形成 “特异性检测 + 广谱筛查” 互补的完整体系：以鲎试验法（含天然 LAL 与重组 rCR/rFC 试剂）作为细菌内毒素的特异性检测手段，凭借 fg 级灵敏度成为制药行业常规质控方法，可通过凝胶法实现定性、动态浊度 / 显色法完成定量；以家兔热原试验作为传统广谱筛查方法，虽操作繁琐（需预试筛选基础体温稳定家兔，正式试验观察 3 小时体温变化），但仍是放射性质的药物、血液制品等高风险产品排除非内毒素热原的补充手段；以单核细胞活化反应测定（MAT）作为新兴全热原检测技术，利用人源单核细胞（如 THP-1 细胞）释放 IL-6、TNF-α 等细胞因子的特性，可同时识别内毒素与非内毒素热原，契合疫苗、基因治疗产品等对风险控制的需求。三种方法协同应用，从原料入厂到成品放行构建全流程热原防控网络，既保证对内毒素的准确监控，又避免非内毒素热原的遗漏风险。

PBMC（外周血单个核细胞）的供体差异会直接导致热原检测结果的波动，主要体现在 IL-6 释放水平的不一致。不同供体的 PBMC，其单核细胞比例、TLR 受体表达量、免疫活性状态存在差异：有的供体 PBMC 受热原刺激后， IL-6 释放量高；有的则极低，甚至无明显响应。实验数据显示， PBMC 的标曲各浓度点相对偏差有高达 171.43%的，正是这种差异的体现，导致热原检测结果难以标准化，无法准确判断供试品热原是否超标，从而增加了药品的质量控制风险。

MAT法（单核细胞活化反应测定）热原检测基于人体免疫反应机制设计，原理是：内毒素（革兰氏阴性菌来源）与非内毒素热原（革兰氏阳性菌、霉菌、病毒等来源）进入人体后，会活化单核细胞或单核细胞系，使其释放 IL-6、IL-1、IL-1β、TNF-α 等促炎细胞因子。检测时将供试品与单核细胞 / 单核细胞系共孵育，再通过 ELISA 定量检测释放的 IL-6 含量，结合内毒素标准品绘制的标曲，即可判断供试品中热原含量是否符合规定，实现内毒素与非内毒素热原的全覆盖检测。

中国药典与欧洲药典对 MAT 热原检测的细胞类型及复孔数有明确要求，且存在细节差异。细胞类型上，两者均认可人全血、PBMC（外周血单个核细胞，至少 4 个供体，欧洲药典建议 8 个供体），中国药典明确将单核细胞系纳入，欧洲药典则要求单核细胞系需做支原体污染检测、细胞鉴别等；检测方法均为 “热原刺激细胞 + ELISA 检测 IL-6/IL-1β/TNF-α”。复孔数方面，两者均规定平行孔≥4、浓度点≥4，中国药典额外要求标曲 r≥0.90，主要目的是通过多重复孔抵消 PBMC 的不稳定性，确保热原检测结果准确可靠。

热原检测技术自 20 世纪初问世以来，经历了 “动物试验→体外生化检测→细胞生物学检测” 的三次关键变革，每一次变革均推动检测效率、准确性与全面性的提升。20 世纪初至中期，热原检测方法只有家兔热原试验，通过观察家兔体温变化筛查热原，虽实现了广谱检测，但存在动物成本高、操作繁琐、灵敏度低、种属差异大等局限，难以满足制药行业快速发展需求。20 世纪 60 年代，鲎试验法（LAL 法）的发明开启了热原检测的 “体外生化时代”，利用鲎血变形细胞裂解物的凝血级联反应检测细菌内毒素，灵敏度提升至 ng 级，检测时间缩短至 1-2 小时，迅速成为制药行业常规质控方法；但该方法依赖鲎资源，易受 β- 葡聚糖干扰，且只能检测内毒素，无法覆盖非内毒素热原。21 世纪以来，重组技术与细胞生物学技术的发展推动热原检测进入 “全热原管控时代”：重组级联试剂（rCR）与重组 C 因子试剂（rFC）通过基因工程技术制备，摆脱对鲎资源的依赖，消除葡聚糖干扰，实现标准化生产；单核细胞活化反应测定（MAT）利用人源单核细胞检测全类型热原，填补非内毒素热原检测空白，且结果更贴近人体实际反应。