浙江疫苗内毒素检测操作步骤

样品中的脂质体与表面活性剂，会通过不同机制干扰内毒素检测，需结合基质特性选择处理方式。脂质体的干扰体现在两方面：一是脂质双分子层会包裹内毒素，使其无法与鲎试剂接触，导致假阴性；二是脂质体的胶体性质会干扰凝胶形成（凝胶法）或光度信号读取（浊度 / 显色法）。针对完整脂质体制剂，可先用生理盐水稀释降低脂质体浓度，减少包裹作用；若需彻底释放内毒素，还可使用 DMSO、乙醇或甲醇等溶剂裂解脂质体，暴露被包裹的内毒素。表面活性剂的干扰则源于其对物质结构的改变：既可能破坏内毒素的聚集体结构，影响其活性；又可能导致鲎试剂中蛋白质变性，抑制反应。对此，可通过内毒素检查用水或生理盐水稀释样品，降低表面活性剂浓度，消除其对结构的破坏作用。这些针对性处理能有效解决脂质体与表面活性剂的干扰，确保内毒素检测结果真实可靠。

内毒素检测的实验方案需遵循“标曲可靠性验证（灵敏度复核）-稀释倍数计算-干扰试验”的完整流程，以保障检测结果准确合规。首先进行标曲可靠性试验，用标准内毒素制备至少3个浓度的稀释液（相邻浓度间稀释倍数不超过10，下限浓度不低于鲎试剂标示检测限），每浓度设 3 支平行管，同时做2支阴性对照；当阴性对照的吸光度小于或透光率大于标准曲线下限的检测值或反应时间大于标准曲线下限的反应时间，对数据进行线性回归，相关系数r的幅值≥0.980时试验方有效，否则需重新操作。接着按公式 L=K/M 确定样本内毒素限值，K 值依给药途径而定，M结合人均60kg体重、1.62m² 体表面积及上限给药剂量计算，也可参考药典行标。随后明确有效稀释上限倍数（MVD），即供试品允许稀释的上限倍数，确保在此范围内检测限值。再开展样本干扰试验，制备供试品溶液（A）、供试品加标溶液（B，加标浓度为标曲中点）、标准曲线溶液（C）及阴性对照（D），按公式 R=(Cs-Ct)/λm×100%计算加标回收率，50%-200%为合格；若鲎试剂、生产工艺等发生变化，需重新进行干扰试验，保障内毒素检测的可靠性。

在內毒素检测的技术体系中，凝胶法与动态显色法基于不同原理与特性，形成互补应用格局。凝胶法依托鲎试剂与内毒素的凝集反应，实现定性或半定量检测，其灵敏度覆盖 0.03EU/ml、0.06EU/ml 等多梯度，60 分钟即可完成反应；检测结果依赖肉眼观察（180° 倒转判读凝胶形成），数据需手工记录，配套 内毒素凝胶法测定仪（恒温仪） 即可开展，虽自动化程度有限，但操作简洁，适用于生产环节的快速初筛。与之相比，动态显色法通过监测反应混合物吸光度或透光率的变化（如达预设检测值的反应时间、信号增速）实现 定量检测 ，灵敏度拓展至 5-0.005EU/ml ，60-90 分钟反应时长虽略长，却可借助酶标仪或全自动内毒素检测分析仪完成全流程自动化操作—软件实时采集数据，契合药品生产质量管理规范（GMP）对数据追溯与精度的要求。二者各有侧重：凝胶法以 “快速定性” 服务基础防控，动态显色法凭 “准确定量 + 自动化” 支撑严苛质控，共同为內毒素检测提供灵活适配的技术路径。

低内毒素回收（LER）又称内毒素掩蔽，是指无菌制剂（尤其蛋白类生物制剂）进行内毒素检测时，加标内毒素的回收率＜50% 的现象，且无法通过稀释排除，区别于传统检测干扰。LER 会导致内毒素污染被低估，已被全球监管机构重点关注：FDA 2013 年要求生物药 BLA 申报时提交 LER 研究报告；EMA 2023 年明确含表面活性剂（如吐温）或螯合剂（如 EDTA）的制剂需提供 LER 数据；中国药典 2025 版 9251 通则也新增 LER 内容，与国际接轨。这些要求促使企业优化内毒素检测流程，避免因 LER 导致的检测偏差，确保药品安全。

内毒素检测结果误差可能源于多环节：试剂方面，鲎试剂（LAL ）或试剂批间差异、过期试剂活性下降会导致结果偏差，需通过试剂验收（如阳性对照回收率验证）确保质量；操作方面，实验器具未除热原（如玻璃器皿未干热灭菌）、加样体积不准确会引入污染或误差，需严格执行 SOP（如器皿 250℃干热灭菌≥30 分钟）；环境方面，实验室空气中的微生物孢子、粉尘可能污染样品，需在洁净工作台操作并设置阴性对照。此外，反应温度波动（偏离 37℃±1℃）会影响酶活性，需使用恒温孵育器精确控温，确保反应条件稳定。

湖州申科生物凝胶法鲎试剂是根据凝集反应所形成凝胶的坚实程度来限量检测样本中细菌内毒素含量。常用于人用和动物用注射药物、生物制品及医疗器械等领域中定性或半定量地测定细菌内毒素含量。本品为海洋生物鲎的血液变形细胞溶胞物的冷冻干燥制品,内含能被微量细菌内毒素活化的凝固酶原(Proclotting enzyme)和凝固酶蛋白(Coagulogen)。在适宜的条件下(温度、pH值及无干扰物质),细菌内毒素能活化鲎试剂中的凝固酶原,使备试剂产生凝集反应形成凝胶。本品可以快速、准确地检测样品中的内毒素水平，提高实验效率,保障实验结果的可靠性。