单核细胞活化反应测定（MAT）是近年来热原检测领域的突破性技术，其原理基于人体免疫系统对热原的天然应答机制：人源单核细胞（如 THP-1 细胞系或新鲜人全血单核细胞）在热原刺激下，会活化胞内炎症信号通路，释放 IL-6、TNF-α 等促炎细胞因子，通过 ELISA 检测细胞因子的浓度，即可间接反映样品中热原的总量与活性。与传统检测方法相比，MAT 法具备三大不可替代的优势：一是广谱性，可同时检测细菌内毒素、病毒、真菌毒素、支原体等所有类型热原，填补了鲎试验法只能检测内毒素的 “非内毒素热原盲区”，尤其适用于疫苗、基因治疗产品等易受多种热原污染的高风险产品；二是人源相关性，采用与人体同源的细胞模型，检测结果更贴近临床实际热原反应，避免家兔试验中动物种属差异导致的误判；三是高灵敏度，对细菌内毒素的检测限可达 0.0125EU/mL，对非内毒素热原（如酵母多糖、腺病毒）的检测限低至 ng/pg 级，满足低限值产品的质控需求。
湖州申科热原检测试剂盒联合了国内相关机构室间验证，与传统RPT法结果高度一致，符合法规要求。江苏疫苗热原检测欧盟出口方案
中国药典对 MAT 法热原检测要求 4 复孔，未明确 CV 限值，需结合细胞实验特性合理解读与操作。药典不设 CV 限值的主要原因是：MAT 法基于细胞反应，细胞活性易受环境微小变化（如温度、pH）影响，存在天然不稳定性，过严的 CV 要求可能脱离实际；但实验室可通过积累多批次数据，制定内部 CV 控制范围（如定量上下限 CV≤30%、25%），确保检测重复性。关于 3 复孔的适用性：若长期数据显示 CV 控制良好（如连续 10 批次 CV<20%），且样品为中间过程检测（非 QC 放行），可尝试 3 复孔，但需同步设置加标对照，验证结果可靠性；若为 QC 放行检测，仍建议按 4 复孔操作，符合药典下限要求。对于异常点处理，可采用狄克逊准则（Q 检验）等统计学方法 —— 如某复孔 IL-6 检测值偏离平均值 30% 以上，且无明显操作误差（如加样错误），可判定为异常点并剔除，但需在原始记录中详细说明原因，确保数据可追溯，避免随意剔除导致结果失真。
河北热原检测合规申报MAT 法通过热原活化单核细胞 TLR 受体，释放 IL-6 等细胞因子，ELISA 检测 IL-6 推算热原含量。
PBMC（外周血单个核细胞）的供体差异会直接导致热原检测结果的波动，主要体现在 IL-6 释放水平的不一致。不同供体的 PBMC，其单核细胞比例、TLR 受体表达量、免疫活性状态存在差异：有的供体 PBMC 受热原刺激后， IL-6 释放量高；有的则极低，甚至无明显响应。实验数据显示， PBMC 的标曲各浓度点相对偏差有高达 171.43%的，正是这种差异的体现，导致热原检测结果难以标准化，无法准确判断供试品热原是否超标，从而增加了药品的质量控制风险。
MAT 试剂盒热原检测配套细胞的质量控制，是保障检测结果可靠的重要环节，需从功能、安全性、稳定性三方面建立体系。在功能鉴定上，按欧洲 MAT 法要求，需检测细胞的 Toll 样受体（TLR1-TLR9）表达情况—确保细胞能响应不同类型热原（如 TLR4 响应 LPS、TLR2/6 响应脂磷壁酸）；同时考察细胞倍增时间（确保活性稳定）、热原反应性（对标准内毒素和非内毒素热原的信号强度），确保细胞具备热原识别与炎症因子分泌能力。在安全性检测上，需验证细胞无菌（无细菌、真菌污染）、无支原体、无外源病毒因子（如 HIV、HBV）及分枝杆菌，避免外源污染影响检测结果。在稳定性考察上，需监测不同代次细胞的热原刺激敏感性，一般要求细胞使用代次不超过 20 代，代次过高会导致 TLR 表达下降、炎症因子分泌减少，影响检测灵敏度。湖州申科的配套细胞还额外通过 Western blot 验证 TLR 受体表达量，并用不同非内毒素热原配体刺激验证响应性，形成全维度质量控制，确保细胞适配热原检测需求。
MAT 法干扰试验需设 3 个样品浓度梯度（A、2A、4A 倍），均不超过MVD且加标回收合格。
热原检测MAT法的法规地位持续提升，已成为多国药典认可的热原检测替代方法。欧洲药典（EP）是推动 MAT 应用的关键力量：通则 2.6.30 明确 MAT 可替代家兔热原试验（RPT），且能同时检测内毒素与非内毒素热原；2024 年欧洲药典委员会批准删除所有条款中的家兔法，修订文本将于 2025 年7月1日生效，强制鼓励使用 MAT 等体外替代方法。美国药典（USP）<151> 规定，经验证的体外热原试验（如 MAT）可替代家兔法，且需依据 USP<1225>开展验证；FDA 行业指南进一步明确 MAT 的合规性。中国药典 2020 年版通则 9301 将 MAT 列为热原检查的补充方法，虽暂未替代家兔法，但明确其适用于复杂基质样品的全热原筛查。此外，ISO 10993-1、ICCVAM 等国际标准也优先推荐体外热原检测模型，全球法规协同推动 MAT 成为热原检测的主流技术。
单核细胞系传代可控，20代以内TLR表达与炎症因子分泌保持稳定，确保热原响应一致性。非动物源热原检测方法验证
MAT 热原检测中细胞活性影响巨大，活率需达一定标准保证检测效果。江苏疫苗热原检测欧盟出口方案
家兔热原试验作为热原检测领域的 “法定传统方法”，被中国药典（ChP）、美国药典（USP）、欧洲药典（EP）均列为法定检测项目，其主要优势在于可通过家兔体温应答筛查所有类型热原，尤其适用于无法排除非内毒素热原污染的高风险产品，如血液制品、放射性质药物及部分生物制剂。然而，家兔热原试验存在明显局限：动物个体差异大，需额外投入时间与成本筛选合格家兔；检测周期长（至少 6 小时），无法满足生物制品快速放行需求；灵敏度较低（对 LPS 检测限≥5EU/kg），与全球倡导的“动物福利3R原则”背道而驰。
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