江苏高效热原检测单核细胞活化反应测定法

MAT 法与传统家兔法在热原检测中，性能差异明显，MAT 法在准确性、效率与合规性上更具优势。从结果评判来看，MAT 法以 “加标回收率 50%-200%、供试品浓度 < 规定限值（CLC）” 为合格标准，灵敏度达 0.0125EU/mL，可准确定量热原浓度；而家兔法只能定性（观察体温升高），灵敏度低（约 0.1-0.5EU/mL），易因家兔个体差异（如免疫状态、应激反应）导致假阴性。从检测效率来看，MAT 法样品与细胞共培养 24 小时即可出结果，且可批量检测（96 孔板一次处理多个样品）；家兔法需连续观察 72 小时，每次只能检测少量样品，耗时且人力成本高。从合规性来看，MAT 法不使用动物，符合 3R 原则，已被欧盟接受（EP 删除家兔法）；家兔法因动物实验属性，面临欧盟等地区的法规限制。此外，MAT 法重复性优（复孔 CV 可控制在 30% 以内），家兔法因个体差异 CV 常超 50%，进一步凸显 MAT 法在现代热原检测中的优势。

MAT 法热原检测的稳定性需从细胞、试剂、操作、样品四维度严格把控。细胞层面，细胞活性与纯度直接决定热原响应能力，活性不足会减少炎症因子分泌，纯度低则引入杂细胞干扰；细胞批次间一致性也关键，TLR 受体表达、倍增时间差异会导致结果波动。试剂与耗材方面，标准品效价需溯源国际标准，避免降解影响标曲；试剂盒中细胞因子需质控，防止外源热原污染；培养液、缓冲液及无热原耗材（吸头、西林瓶）若热原控制不当，易引发假阳性。操作上，加样手法要统一（如 8 通道移液器液面一致），孵育需 37℃、5% CO₂稳定环境，试剂配制浓度准确，设备（酶标仪、洗板机）定期校准，操作偏差会直接导致异常。样品层面，自身干扰物质（消除炎症成分、高盐）、pH 偏离 6-8 或微生物污染，会抑制细胞活化或引入外源热原，需针对性预处理。

热原检测MAT法的法规地位持续提升，已成为多国药典认可的热原检测替代方法。欧洲药典（EP）是推动 MAT 应用的关键力量：通则 2.6.30 明确 MAT 可替代家兔热原试验（RPT），且能同时检测内毒素与非内毒素热原；2024 年欧洲药典委员会批准删除所有条款中的家兔法，修订文本将于 2025 年7月1日生效，强制鼓励使用 MAT 等体外替代方法。美国药典（USP）<151> 规定，经验证的体外热原试验（如 MAT）可替代家兔法，且需依据 USP<1225>开展验证；FDA 行业指南进一步明确 MAT 的合规性。中国药典 2020 年版通则 9301 将 MAT 列为热原检查的补充方法，虽暂未替代家兔法，但明确其适用于复杂基质样品的全热原筛查。此外，ISO 10993-1、ICCVAM 等国际标准也优先推荐体外热原检测模型，全球法规协同推动 MAT 成为热原检测的主流技术。

MAT 法热原检测标曲采用非倍比稀释，而非 1-0.5-0.25 的倍比稀释，主要优势在于提升标曲准确性与适用性，避免稀释误差影响。一是可密集覆盖关键浓度区间：热原检测的重点关注区为低浓度拐点（如 0.0125-0.1EU/mL）与高浓度平台区（如 0.5-1EU/mL），非倍比稀释可在这些区间设置更多浓度点（如 0.0125、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1EU/mL），提升曲线拟合精度，而倍比稀释低浓度点少，易导致低浓度热原定量不准。二是降低稀释误差累积：倍比稀释需连续稀释（如 1EU/mL→0.5EU/mL→0.25EU/mL），每一步误差会累积，导致低浓度点实际浓度偏离理论值；非倍比稀释通过单独配制每个浓度点（如直接用标准品配制 0.025EU/mL），避免误差累积，提升标曲可靠性。三是适配不同样品浓度：非倍比稀释可根据样品预期浓度调整标曲范围，如样品预期浓度 0.05EU/mL，可增加 0.025、0.05、0.1EU/mL 点，确保样品浓度落在标曲线性区，而倍比稀释范围固定，灵活性差。这些优势使非倍比稀释成为 MAT 法标曲配制的优先选择方式。

单核细胞系凭借标准化、可控性等优势，有效解决PBMC（外周血单个核细胞）在热原检测中的局限。其一，单核细胞系源自永生化细胞株（如 Mono-Mac-6），经筛选后细胞特性高度均一，消除供体差异，让热原检测结果稳定性大幅提升。其二，其培养过程可控，培养基配方与环境（温度、CO₂浓度）可准确调控，能维持细胞好的活性，避免 PBMC 因分选、冻存导致的活性衰减。其三，对培养环境波动耐受性更强，可保障细胞遗传稳定且无污染物风险，降低热原检测的操作复杂度与误差率。

MAT法热原检测中，ELISA 加终止液后的读数时间需严格控制，以保障 IL-6 检测信号稳定。湖州申科生物MAT试剂盒说明书明确要求，终止液添加后需在 10 分钟内完成读数，且需避光操作 —— 原因在于，终止液（如硫酸）会终止 TMB 显色反应，但生成的黄色产物在光照下易降解，超过 10 分钟后 OD 值会下降，导致 IL-6 检测值偏低。读数前需进行 30 秒震荡混匀，确保孔内液体浓度均匀，避免因局部浓度差异导致复孔 OD 值波动。酶标仪波长需设置为 450nm，若仪器含 600nm 参考波长，可同时检测 600nm 波长以扣除背景干扰（如细胞碎片导致的光散射），提升检测准确性。需注意的是，读数时不可覆盖封板膜或盖子，避免膜上凝结的水蒸气滴入孔中，导致 OD 值异常升高。若因仪器故障无法及时读数，需将微孔板密封后置于 4℃避光保存，并在 30 分钟内完成读数，同时在记录中注明延迟原因，评估延迟对结果的影响（如延迟 20 分钟，OD 值可能下降 15%，需校正后使用）。