苏州原位冷冻电镜技术用途

冷冻电镜技术，是用于扫描电镜的很低温冷冻制样及传输技术(Cryo-SEM)，可实现直接观察液体、半液体及对电子束敏感的样品，如生物、高分子材料等。电镜观察：样品经过很低温冷冻、断裂、镀膜制样（喷金/喷碳）等处理后，通过冷冻传输系统放入电镜内的冷台（温度可至-185℃）即可进行观察。其中，快速冷冻技术可使水在低温状态下呈玻璃态，减少冰晶的产生，从而不影响样品本身结构，冷冻传输系统保证在低温状态下对样品进行电镜观察。冷冻电镜技术，是一种重要的结构生物学研究方法。苏州原位冷冻电镜技术用途

冷冻电镜技术的原理：透射电镜成像过程中，电子束穿透样品，将样品的三维电势密度分布函数沿着电子束的传播方向投影至与传播方向垂直的二维平面上。1968年，AronKlug发现ZX截面定理，提出可以通过三维物体不同角度的二维投影在计算机内进行三维重构来解析获得物体的三维结构。根据这一原理，利用透射电镜获得生物样品多个角度的放大电子显微图像，即有可能在计算机里重构出它的三维空间结构。在冷冻电子显微学结构解析的具体实践中，依据不同生物样品的性质及特点，可以采取不同的显微镜成像及三维重构方法。目前主要使用的几种冷冻电子显微学结构解析方法包括：电子晶体学、单颗粒重构技术、电子断层扫描重构技术等，它们分别针对不同的生物大分子复合体及亚细胞结构进行解析。苏州原位冷冻电镜技术用途冷冻电镜技术将在研究对象、分辨率水平和研究方法等各个方面取得重大进展。

低温冷冻透射电镜技术的特点：相对于常温透射电镜，低温透射电镜的优势有：①快速冷冻制样技术将样品固定在玻璃态的冰层中，避免了水或溶剂结晶对样品结构的破坏，能够保持液相中有机分子自组装体和化学反应中间体的微观结构，避免了样品干燥引起的结构变化;②高分子及化学反应体系常常具有非平衡态结构，快速冷冻制样技术能够保持住非平衡态结构，进而得以观察;③低温条件能够尽可能保持有机和高分子等软物质材料的微观结构，明显减少电子束对样品的损伤。

冷冻电子显微镜技术具有研究对象普遍、样品需求量少、更接近生理状态等独特优势，随着电子显微镜的硬件设备和结构解析的软件算法等方面不断取得的重要突破，冷冻电镜技术必将在研究对象、分辨率水平和研究方法等各个方面取得重大进展。当然，冷冻电镜技术也面临着许多技术上的挑战，怎样改进样品的制备技术，如何如何客观地对三维重构的结果进行检验、明确结构解析的分辨率以及对生物大分子构象不均一性的分析等仍然是冷冻电镜研究中有待解决的重要问题。但是，挑战越多，机遇也就越多。相信有关的研究者们，一定能够冷静抓住机遇，勇敢迎接挑战，让冷冻电镜技术在结构生物学、细胞生物学等领域发挥更大的作用，帮助我们更加深入、透彻地研究各种生命现象。冷冻电镜技术与X射线晶体学、核磁共振一起构成了高分辨率结构生物学研究的基础。

冷冻电镜技术在结构生物学中的应用：冷冻电镜技术主要应用在单个蛋白质分子结构的分析方面。此外，冷冻电子显微镜技术还将普遍应用于细胞组织的超微结构解析，对解开生命活动的规律和机制等奥秘会产生更大影响。有人创造了利用冷冻电镜单颗粒分析技术解析至近原子分辨率的分子量较小的生物大分子的记录。施一公研究组解析了γ-secretase蛋白质和RyR-1蛋白质。研究组解析了Mammalianrespirasome蛋白质。随着越来越多蛋白质神秘面纱的揭开，我们可以更好地解释各种各样的生命活动发生的原因和机理。利用冷冻电镜技术观察到的蛋白质结构，我们可以定向改造或构建新的蛋白质用于科研或医疗领域。冷冻电子显微技术主要包括单颗粒冷冻电镜技术和冷冻电子断层扫描技术。苏州原位冷冻电镜技术用途

冷冻电镜“分辨率改变”使其成为获得优于3Å结构的常规技术。苏州原位冷冻电镜技术用途

单颗粒冷冻电镜技术的颗粒挑选：接下来需要从原始数据中筛选出颗粒投影，也被称为“颗粒挑选”，颗粒挑选的好坏也将影响所有后续的分析和处理过程，是一个重要并且繁琐的步骤。颗粒挑选方式可以分为手动挑选、半自动挑选和完全自动挑选这几种。在早期的分析中，对于结构的了解还非常少，优先考虑的都是人工挑选。但是自动的颗粒图像获取方法的出现使得在很短时间内可以收集数十万张颗粒图像，人工挑选大量的颗粒图像不太现实，并且人工的挑选通常会过于集中于某一类颗粒图像，导致遗漏和偏差。半自动和全自动的方法主要有以下三类：(1)通过例如降噪、反衬增强、边缘算子等图像形态学方法搜索区域，基于数字图像处理学的原理，将颗粒图像与背景分离开来。(2)基于模板的方法，通过扫描数据图像和已知的模板比较来挑选出潜在的颗粒图像，模板的来源通常为手动选出的数据图像中较为清晰的颗粒图像，或者是已知结构的投影。(3)结合无模板和有模板的方法，通过一些有监督的机器学习算法进行颗粒挑选。苏州原位冷冻电镜技术用途

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