PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即：引物(PCR引物为DNA的片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。引物有多种设计方法，由PCR在实验中的目的决定，但基本原则相同。PCR所用的酶主要有两种来源：Taq和Pfu，分别来自两种不同的噬热菌。其中Taq扩增效率高但易发生错配。Pfu扩增效率弱但有纠错功能。所以实际使用时根据需要必须做不同的选择。模板即扩增用的DNA，可以是任何来源，但有两个原则，1号纯度必须较高，第二浓度不能太高以免抑制。缓冲液的成分较为复杂，除水外一般包括四个有效成分：缓冲体系，一般使用HEPES或MOPS缓冲体系；一价阳离子，一般采用钾离子，但在特殊情况下也可使用铵根离子；二价阳离子，即镁离子，根据反应体系确定，除特殊情况外不需调整；辅助成分，常见的有DMSO、甘油等，主要用来保持酶的活性和帮助DNA解除缠绕结构。做一次pcr检测要多久？黑龙江推荐pcr扩增
PCR反应的比较大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头疼的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。主要原因有：1、标本间交叉污染；2、PCR试剂的污染；3、PCR扩增产物污染；4、实验室中克隆质粒的污染。一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。1、阳性对照：在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。2、阴性对照：每次PCR实验务必做阴性对照。它包括：（1）标本对照：被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照；被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。（2）试剂对照：在PCR试剂中不加模板DNA或RNA,进行PCR扩增，以监测试剂是否污染。3、重复性试验。4、选择不同区域的引物进行PCR扩增。内蒙古靠谱pcr英瀚斯分子生物学检测平台，信得过的pcr检测。
PCR实验室设计的中心问题是如何避免污染。在实际工作中，常见的有以下几种污染类型：扩增产物的污染；天然基因组DNA的污染；试剂的污染以及标本间的污染。由于一旦发生污染，实验就必须停止，直到找到污染源为止，而且实验结果必须作废，需重新进行实验。所以发生污染后再围绕实验室来寻找污染源不但耗时而且繁琐，浪费人力物力。因此要避免污染，首先应是预防，而不是排除。PCR扩增检验实验室原则上分为四个单独的工作区域：试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区、扩增产物分析区。为避免交叉污染，进入各个工作区域必须严格遵循单一方向进行，即只能从试剂贮存和准备区→标本制备区→扩增反应混合物配制和扩增区→扩增产物分析区。 各实验区之间的试剂及样品传递应通过传递窗进行。
PCR实验技术中的定量PCR（QuantitativePCR）介绍：由于序列扩增的产量依赖于模板DNA的量，所以PCR常用于对样品中DNA进行定量，常用的应用是基因表达的定量。终点法PCR是一种可能的方法，但其有较大的缺点，通过凝胶电泳来检测产量，检测的灵敏度非常有限。更重要的是，使用终点PCR是在PCR反应结束后进行定量，此时扩增已经达到平台期（图11），DNA凝胶染色的强度与DNA起始量不成线性关系。尽管如此，通过终点法PCR可以对基因表达进行半定量，可以使用一系列稀释程度不同的DNA样本作为模板起始量，或者在特定的PCR循环处获取扩增产物，然后通过凝胶显色强度来估计基因的表达量。做pcr，样本该如何保存？
PCR的假阳性主要原因之一出现非特异性扩增带：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法（93℃变性，65℃左右退火与延伸）。PCR的假阳性主要原因之一出现片状拖带或涂抹带：PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度。增加模板量，减少循环次数。荧光定量pcr正常值多少？内蒙古样本pcr要多久
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