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Real-timePCR技术服务基本参数
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Real-timePCR技术服务企业商机

Real-time PCR:使用Real-time PCR进行基因检测,被普遍应用于病毒和病原菌检测、转基因食品检测、遗传病基因检测等领域。一般首先需要利用专业使用的试剂盒从待检样品中提取其核酸(DNAorRNA),并经过精制等复杂的操作(通常称为前处理操作)之后才可以进行Real-time PCR。不易受反应阻害物的影响,使用时不需要进行复杂的前处理操作,单单需将待检样品直接加入到检测试剂中即可开始检测。通过使用本产品,可以在更短的时间内,简便、低成本地进行Real-time PCR检测。Real-time PCR可看作是生物体外的特殊DNA复制。厦门微量RT-PCR检测技术原理及步骤

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为了便于对所检测样本进行比较,在real-timeQ-PCR反应的指数期,首先需设定一定荧光信号的域值,一般这个域值(threshold)是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号(baseline),荧光域值的缺省设置是3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。如果检测到荧光信号超过域值被认为是真正的信号,它可用于定义样本的域值循环数(Ct)。Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,因此只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。南京血液荧光PCR网站实时荧光定量PCR实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度。

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Real-time PCR链式反应:每次循环都得加入新的DNA聚合酶,不但操作烦琐,而且价格昂贵,制约了PCR技术的应用和发展。耐热DNA聚合酶-Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义,该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活,不需要每个循环加酶,使PCR技术变得非常简捷、同时也降低了成本,PCR技术得以大量应用,并逐步应用于临床。多重连接依赖探针扩增允许用单个引物对扩增多个靶标,从而避免多重PCR的分辨率限制。引物的设计注意事项:1,注意引物设计好后的产物长度。Real-time PCR的较佳产物长度在150-250kb左右(书上说这样可以增加荧光的敏感度,减少实验误差,但是我对这个说法持怀疑态度。产物长度越大,SYBR嵌入的越多,这样才能够保证之后的荧光值比较可信)。2,不同的管家基因扩增效率不同。所以在做整个实验之前应该做一次检测扩增效率的实验。如果扩增效率相差太大,就不能使用delt,deltCt法来比较基因表达量的高低。

Real-time PCR式反应准备:10×扩增缓冲液、4种dNTP混合物(终浓度)、引物(终浓度)、模板DNA、TaqDNA聚合酶、Mg2+(终浓度)、补加双蒸水等。其中dNTP、引物、模板DNA、TaqDNA聚合酶以及Mg2+的加量(或浓度)可根据实验调整,以上表格只提供大致参考值。PCR反应五要素:参加PCR反应的物质主要有五种即:引物(PCR引物为DN段,细胞内DNA复制的引物为一段RNA链)、酶、dNTP、模板和缓冲液(其中需要Mg2+)。引物有多种设计方法,由PCR在实验中的目的决定,但基本原则相同。所谓Real-time PCR技术,是指在PCR反应体系中加入萤光基团。

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Real-time PCR探针法适用于:1、具有高适应性和可靠性,实验结果稳定重複性好,特异性更高。2、适用于扩增序列专一的体系的检测。3、样品中靶基因含量过低的定量PCR检测。4、靶基因的特异序列较短,无论怎样较佳化引物设计条件都不能解决。5、存在与靶基因同源的序列,在PCR中容易出现非特异性扩增,对特异性要求较高的定量。6、普遍用于人类传染病的诊断和病原定量,在动物病原体基因的检测,畜禽产品的检验检疫,生物製品的鉴定。Real-time PCR探针法:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的萤光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告萤光基团和一个淬灭萤光基团。探针完整时,报告基团发射的萤光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告萤光基团和淬灭萤光基团分离,从而萤光监测系统可接收到萤光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个萤光分子形成,实现了萤光信号的累积与PCR产物形成完全同步。Real-time PCR探针法适用于扩增序列专一的体系的检测。杭州血液PCR检测技术研究方案

聚合酶链式反应又称多聚酶链式反应。厦门微量RT-PCR检测技术原理及步骤

Real-time PCR-传统定量PCR:1)内参照法:在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物,内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记,下游引物不标记。在模板扩增的同时,内标也被扩增。在PCR产物中,由于内标与靶模板的长度不同,二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来,分别测定其荧光强度,以内标为对照定量待检测模板。2)竞争法:选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中,待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增(其中一个引物为荧光标记)。厦门微量RT-PCR检测技术原理及步骤

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深圳微量荧光PCR设计公司 2024-12-26

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