丽水微量Real-time PCR

聚合酶链式反应准备：PCR引物设计，PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。引物设计的基本原则：引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC很好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。Real-time PCR技术已经被普遍用于监测细胞mRNA表达量的变化。丽水微量Real-time PCR

Real-time PCR的染料法和探针法的选择：进行mRNA表达量的测定，采用染料法是比较经济实惠的；染料法可以通过比较熔解曲线的熔解峰位置得到产物特异性的情况；目的基因和内参基因分管检测，染料法可以选用Realtime染料PCRPreMIX，探针法主要应用于病毒RNA的检测；以及单位点突变（SNP）；多基因的合并检测，探针法还可用于同一个反应中同时检测目的基因和内参基因的情况；而染料法则必须分管检测。Real-time PCR：实时荧光定量PCR技术（Real-timequantitativePolymeraseChainReaction简称Real-time PCR）是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，之后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(orcDNA)的起始浓度进行定量的方法。丽水组织Real-time PCR定量聚合酶链反应或者实时聚合酶链反应不要与逆转录允许估计样品中存在的给定序列的量。

Real-time PCR：1.DNA或RNA的定量分析：Real-time PCR包括病原微生物或病毒含量的检测,转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi基因失活率的检测等；2.基因表达差异分析：例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等)，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA晶片或差显结果的确证；3.基因分型：例如SNP检测，甲基化检测等。Real-time PCR常用的两种方法分别为Sybrgreen（萤光染料掺入法）和Taqmanprobe（探针法）。

Real-time PCR-传统定量PCR：扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，之后酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。许多疾病的未知病因的测序正在通过聚合酶链反应得到解决。

Real-time PCR实验常用的RNA酶抑制剂：1.焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。2.异硫氰酸胍：目前被认为是较有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。3.氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。4.RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。5.其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。Real-time PCR探针法普遍用于人类传染病的诊断和病原定量。南通骨头RT-PCR检测技术应用

聚合酶链反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液。丽水微量Real-time PCR

Real-time PCR链反应的常见问题分析与解决方法：反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。引物特异性差。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。引物量过多。减少反应体系中引物的用量。模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng，而基因组DNA则应<200ng。外源DNA污染。确保操作的洁净。阴性对照出现条带：试剂，头，工作台污染。使用全新的试剂和头，对工作台进行清洁。条带大小与理论不符：污染。使用全新的试剂和头，对工作台进行清洁。模板或引物使用错误。更换引物和模板。基因亚型。对研究的基因进行序列分析和BLAST研究。逆转录-聚合酶链反应较广用于表达谱，以确定基因的表达或鉴定RNA转录物的序列。丽水微量Real-time PCR

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