合肥细胞生物学离子通道技术

膜片钳使用操作流程及注意事项：1.实验结束后必须关闭实验室的水电，检查实验室门窗。2.凡是在本平台使用仪器的同学必须履行实验室相关要求，完成值日等相关工作（值日生按照实验室统一所发值日生要求履职）。3.在仪器使用以前及使用之后按按照使用时长做好登记工作。4.拉制仪提前预热（至少30min）。且用完及时关闭。电热加热线温度很高，在使用时注意避免烫伤。4.电脑里面的软件不得随意删改，不得在本机电脑下载别的软件，拷数据时需用实验室配置的U盘。5.禁止私拉电线，如有实验要求可与老师及时沟通。全自动膜片钳系统技术指标：软件的功能全部，可按照操作者设定的参数方案自动执行实验。合肥细胞生物学离子通道技术

膜片钳实验中电极制备之分两次拉制，首先次拉长7～10mm，直径小于200μm，在此基础上进行第二次拉制，较终使尖锐端的直径为1～2μm，两步拉制的目的主要是使电极前端的锥度变大，狭窄部长度缩短，因此可降低电极的串联电阻，也可减少全细胞记录时的电极液透析时间。由于膜片微电极较忌沾染灰尘和脏物，更忌触碰尖锐端附近部位，所以一般要求在使用前制作。抛光：将电极固定于显微镜工作台上，在镜下将尖锐端靠近加热丝，当通电加热时，可见电极尖锐端微微回缩，此时电极变得光滑，且尖锐端的杂质烧去，得到较干净的表面。从而有利于和细胞膜紧密封接，并在封接后更易保持稳定。绍兴医学脑片膜片钳网站全自动膜片钳系统技术指标：药液交换非常迅速，作用时间快。

膜片钳技术操作方法：开始封接:调低微操步进速度，使电极尖锐端慢慢向细胞靠近，如发现基线方波突然变小，封接电阻上升时，即停止电极下降，通过注射器给电极负压，封接成功的可见方波很快变小，电阻升至G欧。此时，调节快电容补偿按钮，将快电容电流补偿掉，如封接稳定后，准备破膜。破膜:在钳制电位水平-60mV时，漏电流<20pA，给予比较大的负压(也可根据情况使用ZAP电破方式破膜)，将要破时可见基线上下浮动，破后，可见基线前后有两个较大的慢电容电流。

膜片钳技术是通过微玻管电极（膜片电极或膜片吸管）接触细胞膜，用千兆欧姆以上的阻抗使之封接，在电学上分隔和电极尖开口处相接的细胞膜的小区域（膜片）以及其周围，在此基础上固定点位，对这膜片上的离子通道的离子电流（pA级）进行监测记录的方法。测量回路的中心部分是使用场效应管运算放大器构成的I-V转换器。当场效应管运算放大器的正负输入端子是等电位，向正输入端子施加指令电位时，因为短路负端子以及膜片都可等电位地达到钳制的作用，字膜片微电极与默片之间形成10GΩ以上封接时，其间达到Z小的分流电流。膜片钳技术的应用范围：在神经科学中的研究。

在进行细胞吸附式膜片钳记录时，一般来说，我们通过电压钳（voltageclamp,VC）模式将细胞膜电位维持在-60mV（大多数脊椎动物神经元的静息膜电位），从而保证通过电极尖锐端的电流即为跨膜离子流。一般来说，细胞吸附式膜片钳可以作为对照来验证其他单通道记录构型下通道活动的改变情况，也可以用来检测化学物质引起的通道的和活动/对通道活动的影响是否经过胞内信使的介导。这里有一点需要注意，每个待研究细胞的Em都会有轻微的差异，因此我们在分析cell-attached的数据的时候，需要拿出事先记录好的Em，一般有三种方法:用胞内记录或全细胞记录的方法，获得一个平均Em；在实验结束时，patch破裂，在电流为0的情况下记录到的电势就为Em;结合离子通道的其他数据来反向推算Em。膜片钳使用操作注意：电热加热线温度很高，在使用时注意避免烫伤。温州全自动膜片钳方案

全自动膜片钳系统技术指标：药物消耗极低。每次更换的外液只需十几微升。合肥细胞生物学离子通道技术

膜片钳的数据如何处理：全细胞式膜片方式使细胞内与浴槽之间的漏流极少。电极本身阻抗(1~10mω)与细胞封接后的阻抗相比较低,这种低接触阻抗使单管电压钳容易实现。电极管内与细胞之间弥散交换与平衡快,因而容易控制细胞内液的成分。细胞钳记录的是许多通道的平均电流,有利于综合分析。如果有目的地将膜电位钳制在某一程度,可做到选择性抑制某些通道的活性而只记录某种通道电流的总和,并可在同一细胞上观察几种不同通道的情况。通过改变内部介质,如改变电极液成分,或在电极液中加入所需药物,通过渗透很快改变胞浆成分并达到平衡,该手段在全细胞记录中广泛应用。合肥细胞生物学离子通道技术

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