冷冻电子显微技术学解析生物大分子及细胞结构的中心是透射电子显微镜成像,包括样品制备、图像采集、图像处理及三维重构等几个基本步骤。三维重构:数据处理的较终目的是为了获得生物样品的三维质量密度图,由二维图像推知三维结构的方法即三维重构。其理论原理是在1968年由DeRosier和Klug提出的中心截面定理:一个函数沿某方向投影函数的傅里叶变换等于此函数的傅里叶变换通过原点且垂直于此投影方向的截面函数。由于样品性质的不同,图像分析的方法也有差异。冷冻电镜技术之冷冻透射电镜优点:透镜多,光学性能好。宜昌冷冻电镜技术用途
冷冻电镜技术未来之路在何方?除了蛋白等生物大分子外,生物样品还有很重要的一面是细胞和组织。即使是目前有很多重要的蛋白结构都得到了埃米级别的解析,但由于它们都是纯化出来的,已经脱离了原来位置,就如同一片树叶脱离了大树,研究的再深刻,目前也只是一叶遮目,不要说推测这片树叶在森林里的位置,即使是在哪颗特定大树上的生长部位和结构都很难说。因此解析细胞或组织这样大尺度的高分辨精细结构具有更普遍的生物学意义。深圳单颗粒冷冻电镜技术方案冷冻电镜技术的独特优势:更接近天然状态,不需要蛋白质结晶。
冷冻电镜技术解析结构主要风险在:A.样品很不稳定,样品寄送过来的时候,已经降解或者聚集,无法进行后续处理;B.样品在冷冻制样的过程中,可能会被冻碎,从而无法进行后续处理;C.样品纯度可能很好,但是均一度很差,从而难以获得样品的高分辨结构;D.我们关心的区域可能在整个复合体中有很强的柔性,从而经过二维或者三维平均后,我们关心区域的分辨率会比较差甚至看不见,达不到我们的预期;E.一些配体,比如药物前体分子,分子量太小,不一定能在电镜的密度图中观测到;F.对于合适的样品,我们冷冻制样需要优化的参数有很多,包括样品浓度的优化,blottime的优化,温度的优化,grid规格(铜网或者金网)的优化等一系列条件的优化。因此冷冻电镜制样需要丰富的经验和充足的机时支持,不同的实验者,成功率可能差别很大。
冷冻电镜技术也正在成为助力医药研发的有力手段。依托对蛋白质结构的理解,科学家正在开发更有效的治Ca药、打菌素、止痛药、麻醉剂等。中国过去10多年里,建成了世界上较大的冷冻电镜设施。中国的科学家,也在冷冻电镜领域取得了很多举世瞩目的成就,引起了世界的普遍关注。比如清华大学的施一公团队,对老年痴呆症相关的重要蛋白质结构进行了解析,对于我们理解它的发病机理甚至开发重要治疗方法有重要意义。他们对剪接体复合体一系列结构的研究帮助我们理解细胞的演化、细胞的基因调控和其他一些相关疾病有着重要意义。2019年,中国科学家利用冷冻电镜技术解析到世界上目前分辨率较高的猪瘟病毒结构,这对我们了解该病毒的发病机理,以及如何更好开发疫苗具有重要意义。冷冻电镜技术之冷冻扫描电镜是克服样品含水问题的一个快速、可靠和有效的方法。
单颗粒冷冻电镜技术的图像处理技术:经过多年的发展,目前冷冻电镜的数据处理部分主要包含了以下的流程:(1)衬度传递函数的修正(CTFcorrection);(2)样品分子投影数据的筛选(particleselection);(3)二维投影数据的分类和降噪(2Danalysis);(4)三维模型的重构和优化(3Dreconstructionandrefinement);(5)多重构象的结构分析(heterogeneityanalysis);(6)对重建结构分辨率的分析(structureresolutionassessment);(7)结合生物化学原理和实验数据对三维结构的解读(modelinterpretationandvalidation)。冷冻电镜技术与X射线晶体学、核磁共振一起构成了高分辨率结构生物学研究的基础。厦门冷冻电镜技术原理
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冷冻电镜技术基本原理之电镜三维重构理论:D.DeRosier和A.Klug提出三维重构理论是借助一系列沿不同方向投影的电子显微像来重构被测物体的立体构型,利用计算机数字图像处理技术进行电子显微像三维重构测定生物大分子结构的概念和方法。透射电子显微镜成像过程中,电子束穿透样品,将样品的三维电势密度分布函数沿着电子束的传播方向投影至与传播方向垂直的二维平面上。运用中心截面定理,从而可以通过三维物体不同角度的二维投影在计算机内进行三维重构来解析获得物体的三维结构。宜昌冷冻电镜技术用途
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冷冻电镜技术基本原理之三维冷冻电镜技术:样品经过在液氮中的冷冻固定,使得生物大分子中的H2O分子以玻璃态的形式存在,保持低温,将样品放入显微镜,高度相干的电子作为光源从上面照射下来,透过样品和附近的冰层,受到散射,利用探测器和透镜系统把散射的信号成像记录下来,再进行信号处理,较后利用三维重构的技术得到样品的三维结构。冷冻电镜技术的独特优势分辨率高:光学显微镜的分辨率为0.2μm,透射电子显微镜的分辨率为0.2nm,透射电子显微镜在光学显微镜的基础上放大了1000倍。冷冻电镜技术也正在成为助力医药研发的有力手段。无锡冷冻透射电镜技术特点冷冻电镜技术的原理:透射电镜成像过程中,电子束穿透样品,将样...