莆田生物冷冻透射电子显微镜技术

冷冻电镜技术的原理：透射电镜成像过程中，电子束穿透样品，将样品的三维电势密度分布函数沿着电子束的传播方向投影至与传播方向垂直的二维平面上。1968年，AronKlug发现ZX截面定理，提出可以通过三维物体不同角度的二维投影在计算机内进行三维重构来解析获得物体的三维结构。根据这一原理，利用透射电镜获得生物样品多个角度的放大电子显微图像，即有可能在计算机里重构出它的三维空间结构。在冷冻电子显微学结构解析的具体实践中，依据不同生物样品的性质及特点，可以采取不同的显微镜成像及三维重构方法。目前主要使用的几种冷冻电子显微学结构解析方法包括：电子晶体学、单颗粒重构技术、电子断层扫描重构技术等，它们分别针对不同的生物大分子复合体及亚细胞结构进行解析。冷冻电镜技术之冷冻透射电镜通常是在普通透射电镜上加装样品冷冻设备。莆田生物冷冻透射电子显微镜技术

冷冻电镜技术解析结构的一般流程是怎样的？对样品的要求是什么？冷冻电镜解析蛋白结构一般流程为：蛋白表达纯化；负染样品准备：约2小时完成；负染样品的数据收集：约8小时完成；冷冻样品的准备：约4小时完成；冷冻样品的数据收集：48-120小时完成。三维结构重建。冷冻电镜解析蛋白结构对蛋白质的要求：分子量：一般需要样品的分子量在200kD以上。缓冲液：缓冲液中不能含有多糖，DMSO，甘油等有机物质，这些会降低样品的衬度，难以获得高分辨的三维结构。一般而言，缓冲液为20mMHepes，150mMNaCl。浓度：一般而言，可溶性蛋白浓度应在1mg/ml左右，膜蛋白应保证浓度在5mg/ml左右。体积：20ul足够（前提是需要蛋白浓度达标，做一个样品3ul左右）。均一性：分子筛行为表现为单一的峰，均一性大于90%。黄山冷冻电子显微镜技术服务公司冷冻电镜技术之冷冻蚀刻电子显微镜优点：冷冻蚀刻的样品，经铂、碳喷镀而制备的复型膜具有很强的立体感。

冷冻电镜技术近年来获得了迅猛的发展，取得了许多具有重大意义的成果。冷冻电镜将生物分子进行冷冻便可进行高分辨率成像，还具有分辨率高、更接近天然状态、适用研究对象普遍等优势。同时，系统地综述了冷冻电镜技术在科学研究中的应用，并展望冷冻电镜技术未来的发展。冷冻电镜（cryo-electronmicroscopy，cryo-EM）技術，是在低温下使用透射电子显微镜观察样品的显微技术，即把样品冷冻并保持低温放进显微镜里面，用高度相干的电子作为光源从上面照射，透过样品和附近的冰层，受到散射，再利用探测器和透镜系统把散射信号成像记录下来，较后进行信号处理，得到样品的结构。

冷冻电子显微镜技术步骤之样品制备：用于冷冻电镜研究的生物样品必须非常纯净。生物样品是在高真空的条件下成像的，所以样品的制备既要能够保持本身的结构又能抗脱水、电子辐射。现在普遍采用的方法是通过快速冷冻使含水样品中的水处于玻璃态，也就是在亲水的支持膜上将含水样品包埋在一层较样品略高的薄冰内。冰的结构多种多样，包括六角形冰、立方体冰等，其物理状态与冷冻速率有关。若要形成玻璃态(即无定形态)的冰，需要冷冻速率达到每秒钟104摄氏度。此时，冰的结构呈现各向同性，不会因成像角度不同而导致图像产生偏差。该方法有两个步骤:一是将样品在载网上形成一薄层水膜:二是将第步获得的含水薄膜样品快速冷冻。在多数情况下，用手工将载网迅速浸入液氮内可使水冷冻成为玻璃态。其优点在于将样品保持在接近生活状态，不会因脱水而变形，同时可以减少辐射损伤。冷冻电镜技术之冷冻透射电镜通过对样品的冷冻，降低电子束对样品的损伤，从而得到更加真实的样品形貌。

冷冻电镜技术之冷冻蚀刻电子显微镜：冷冻蚀刻电镜技术是从50年代开始发展起来的一种将断裂和复型相结合的制备透射电镜样品技术，亦称冷冻断裂或冷冻复型，用于细胞生物学等领域的显微结构研究。冷冻蚀刻电镜的优点：①样品通过冷冻，可使其微细结构接近于活的状态;②样品经冷冻断裂蚀刻后，能够观察到不同劈裂面的微细结构，进而可研究细胞内的膜性结构及内含物结构;③冷冻蚀刻的样品，经铂、碳喷镀而制备的复型膜，具有很强的立体感且能耐受电子束轰击和长期保存。冷冻电子显微技术学解析生物大分子及细胞结构的中心是透射电子显微镜成像。襄阳冷冻透射电镜技术方案

冷冻电子显微镜技术还将普遍应用于细胞组织的超微结构解析，对解开生命活动的规律和机制等产生更大影响。莆田生物冷冻透射电子显微镜技术

冷冻电镜技术之冷冻扫描电镜：扫描电镜工作者都面临着一个不能回避的事实，就是所有生命科学以及许多材料科学的样品都含有液体成分。很多动植物组织的含水量达到98%，这是扫描电镜工作者比较难对付的样品问题。冷冻扫描电镜(Cryo-SEM)技术是克服样品含水问题的一个快速、可靠和有效的方法。这种技术还被普遍地用于观察一些“困难”样品，如那些对电子束敏感的具有不稳定性的样品。各种高压模式如VP、LVESEM的出现，已允许扫描电镜观察未经冷冻和干燥的样品。但是，冷冻扫描电镜仍然是防止样品丢失水分的Z有效方法，它能应用于任何真空状态，包括装于扫描电镜的Peltier台以及向样品室内冲以水汽的装置。冷冻扫描电镜还有一些其他优点，如具有冷冻断裂的能力以及可以通过控制样品升华刻蚀来选择性地去除表面水分(冰)等。莆田生物冷冻透射电子显微镜技术

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