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Real-timePCR技术服务基本参数
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Real-timePCR技术服务企业商机

聚合酶链式:PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;引物的延伸:DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2-4分钟,2-3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 PCR技术敏感性高,特异性强,操作简便、快速,在生命科学研究、食品卫生、医疗、法医及环境监测等诸多方面都具有重要的应用价值。聚合酶链反应可以用于分析病症、微生物或其他疾病状态中基因表达水平的变化。常州血液荧光定量PCR原理

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绝大多数聚合酶链反应方法依赖于热循环。热循环将反应物暴露于加热和冷却的重复循环中,以允许不同的温度依赖性反应——具体地说,脱氧核糖核酸融化和酶-驱动DNA复制。聚合酶链反应使用两种主要试剂-引物(引物是短的单链DN段,称为寡核苷酸,是目标DNA区域的互补序列)和DNA聚合酶。在PCR反应的步,DNA双螺旋结构的两条链在高温下物理分离,这个过程称为脱氧核糖核酸变性。第二步,降低温度,引物与互补的脱氧核糖核酸序列结合。这两条DNA链就变成了模板,以酶促的方式从构成DNA的自由核苷酸中组装出一条新的DNA链。随着聚合酶链反应的进行,产生的DNA本身被用作复制的模板,启动了一个连锁反应,原始的DNA模板是以指数形式放大。常州血液荧光定量PCR原理聚合酶链式反应的引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%。

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聚合酶链式反应的特点:灵敏度高:PCR产物的生成量是以指数方式增加的,能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(μg=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞;在病毒的检测中,PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位);在细菌学中很小检出率为3个细菌。简便、快速:PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶,一次性地将反应液加好后,即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应,一般在2~4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析,不一定要用同位素,无放射性污染、易推广。纯度要求低:不需要分离病毒或细菌及培养细胞,DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。

聚合酶链反应:流聚合酶链反应:一种伪等温PCR方法。将溶液置于热梯度下,而不是反复加热和冷却聚合酶链反应混合物。由此产生的热不稳定性驱动对流流动自动将聚合酶链反应试剂从热区域和冷区域打乱,从而反复启动聚合酶链反应。通过利用混沌流场的出现,可以优化热边界条件和PCR外壳的几何形状等参数,以产生特异和快速的PCR。这种对流聚合酶链反应设置明显降低了设备功率需求和操作时间。逆转录聚合酶链反应(逆转录-聚合酶链反应):用于从RNA中扩增DNA。逆转录酶将核糖核酸逆转录成cDNA ,然后通过聚合酶链反应进行扩增。逆转录-聚合酶链反应较广用于表达谱,以确定基因的表达或鉴定RNA转录物的序列,包括转录起始和终止位点。如果基因的基因组DNA序列是已知的,逆转录-聚合酶链反应可以用来绘制基因中外显子和内含子的位置。基因的5’端(对应于转录起始位点)通常通过 RACE-PCR (快速扩增cDNA末端)中。PCR反应的关键环节有模板核酸的制备,引物的质量与特异性,酶的质量及溴乙锭的使用。

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聚合酶链式反应的常见问题:阴性:需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。引物:引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为:选定一个好的引物合成单位。引物的浓度不但要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效。引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等。序列间特异性聚合酶链反应是一种用于DNA指纹识别的聚合酶链反应方法。温州组织定量PCR原理及步骤

聚合酶链式反应:DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。常州血液荧光定量PCR原理

聚合酶链反应注意事项:在实验过程中要防止RNA的降解,保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中,注意避免mRNA的断裂;为了防止非特异性扩增,必须设阴性对照;内参的设定:主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、β-Actin(β-肌动蛋白)等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差;PCR不能进入平台期,出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数,均应通过单独实验来确定;防止DNA的污染: 采用DNA酶处理RNA; 在可能的情况下,将PCR引物置于基因的不同外显子,以消除基因和mRNA的共线性。常州血液荧光定量PCR原理

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深圳微量荧光PCR设计公司 2024-12-26

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