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PCR的反应条件：Tm=4（G+c）+（A+T），一般在45～55度，温度低容易退火但特异性低；温度高，不容易退火但特异性高。退火时间30秒。延伸温度一般在70～75度这时TaqDNA聚合酶活性很高（150个/S），当引物在16个碱基以下时可采用缓慢升高温度到70～75度的方法，使在低温下就开始合成。一般<1KB时间1分钟即可。当〈1KB时在较后的循环中延长扩增时间。循环次数25～30次。无产物时：取10ul扩增混合液作模板在进行PCR扩增；增加TaqDNA聚合酶浓度；增加循环次数；降低退火温度；加靶DNA量。PCR反应的特异性决定因素为：引物与模板DNA特异正确的结合。厦门组织RT-PCR检测技术供应商

聚合酶链式反应：1976年，中国科学家，发现了稳定的Taq DNA聚合酶，为PCR技术发展也做出了基础性贡献。PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，标本核酸模板在提取过程中，由于吸样污染导致标本间污染；有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散再调温度至DNA聚合酶很适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。武汉实时荧光PCR方案聚合酶链式反应中要确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。

聚合酶链式反应的常见问题：PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些很好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。假阴性：不出现扩增条带。PCR反应的关键环节有模板核酸的制备，引物的质量与特异性，酶的质量及溴乙锭的使用， PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板：模板中含有杂蛋白质，模板中含有Taq酶抑制剂，模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。

聚合酶链反应的常见问题分析与解决方法：无扩增条带：酶失活或在反应体系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果。变性温度是否准确：PCR仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加Taq酶以前，将反应体系95℃加热5-10 min。引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化，或因储存条件不当而失活。引物错误。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。 DNA凝胶电泳时加入阳性对照，确保不是DNA凝胶和PCR程序的问题。重叠延伸聚合酶链反应可以创造特定的长DNA构建体。

聚合酶链式反应的常见问题：靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。出现片状拖带或涂抹带：PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。热启动/冷完成聚合酶链反应是通过新的杂合聚合酶实现的，这些酶在环境温度下不活跃。连云港实时数字PCR网站

为了很大限度地减少污染的可能性，调查人员应该为试剂制备、聚合酶链反应和产品分析预留单独的房间。厦门组织RT-PCR检测技术供应商

聚合酶链反应的一个主要限制是，为了产生允许其选择性扩增的引物，需要关于目标序列的先前信息。这意味着，通常情况下，PCR用户必须知道两个单链模板中每个模板上目标区域上游的精确序列，以确保DNA聚合酶正确结合引物-模板杂交体，并随后在DNA合成过程中产生整个目标区域。像所有酶一样，DNA聚合酶也容易出错，这反过来会导致产生的PCR片段发生突变。PCR的另一个限制是，即使是很少量的污染DNA也可以被扩增，导致误导或模糊的结果。为了很大限度地减少污染的可能性，调查人员应该为试剂制备、聚合酶链反应和产品分析预留单独的房间。试剂应分配到一次性的等分试样中。应经常使用带有一次性柱塞和超长移液器吸头的移液器。厦门组织RT-PCR检测技术供应商